DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu




ŠUMARSKI LIST 3-4/2017 str. 12     <-- 12 -->        PDF

potopljene nesterilnom otopinom tla volumena 25 ml. Zatvorene Petrijeve zdjelice ostavljene su 24 do 48 sati na sobnoj temperaturi i prirodnom režimu svjetlosti, nakon čega se micelij promatrao i fotografirao pod svjetlosnim mikroskopom (Olympus BX41 s ugrađenom digitalnom kamerom Olympus DP20). Iako neki autori (Drenth i Sendall 2001) navode mogućnost korištenja destilirane vode u tu svrhu, u ranijim se istraživanjima za uzorke s istih lokacija nije pokazala učinkovitom (Hegol 2016), stoga su korištene nesterilne otopine tla koncentracija 1 %, 1,5 % te 5 %. Prve dvije otopine dobivene su miješanjem odgovarajuće mase tla (10, odnosno 15 g) u 1 L ultračiste vode (0,055 μS/cm) na magnetskoj miješalici u trajanju od 4 sata, te je gornji vodeni sloj nakon što se tlo istaložilo filtriran gravitacijskom metodom kroz filter papir (Grade 388, Boeco Germany) (Drenth i Sendall 2001, Jeffers i Aldwinckle 1987). Za treću je otopinu 50 g tla potopljeno 1 litrom ultra čiste vode te ostavljeno da odstoji 48 sati, nakon čega je vodeni sloj bez taloga filtriran gravitacijskom metodom kroz filter papir (Grade 388, Boeco Germany) (Jung i sur. 1996). Otopine su čuvane u hladnjaku u tami na 4 °C.
Identifikacija vrsta molekularnim metodama – Species identification using molecular methods
Za molekularne analize odabrana su po dva izolata morfoloških značajki karakterističnih za gljivama slične organizme sa svake istraživane lokacije. Izolacija DNA iz micelija vršena je prilagođenom metodom prema Allemann i sur. (1999) u Molekularno-biološkom laboratoriju Šumarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Izolati su uzgojeni na MEA hranjivim podlogama na sterilnim celofanskim diskovima (Bio-Rad, Cellophane Membrane Backing) u tami na 21 °C. Za izolaciju DNA je odvagano približno 50 mg ovako uzgojenih micelija starih 7 dana za svaki odabrani izolat. Nakon mehaničke homogenizacije tkiva u tekućem dušiku (N2) u mikroepruvetama, uzorcima je dodano 800 μl pufera za lizu (20 mM Tris, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 % SDS, pH 8) i jednak volumen smjese fenol: kloroform: izoamilni alkohol u omjeru 25:24:1. Nakon centrifugiranja (Eppendorf AG 5804 R laboratorijska centrifuga) 10 minuta na 5000xg, vodena faza je otpipetirana u novu mikroepruvetu u koju je dodan jednak volumen otopine kloform:izoamilnog alkohola omjera 24:1. Nakon ponovnog centrifugiranja 10 minuta na 5000xg, vodena faza je otpipetirana u novu mikroepruvetu u koju je dodan jednak volumen izopropanola. Nakon centrifugiranja 20 minuta na 15000xg i 4 °C je supernatant dekantiran, a dobiveni talog DNA ispran s 500 μl ledeno-hladnog 70 % etanola. Mikroepruvete su podvrgnute centrifugiranju 3 minute na 15000xg i 4 °C, nakon čega je etanol dekantiran, a talog DNA osušen približno 10 minuta na zraku te naposljetku otopljen u 50 μl TE pufera (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
Daljnja analiza dobivenih uzoraka DNA izvršena je u laboratoriju tvrtke InovaGen d.o.o. (Zagreb, Hrvatska), a obuhvaćala je lančanu reakciju polimerazom (PCR), kako bi se umnožila ciljana ITS regija te određivanje slijeda nukleotida (sekvence) navedene regije radi identifikacije vrsta. Pritom je za umnažanje ciljane sekvence korišten par početnica ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’) i ITS6 (5’GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG3’) (White i sur. 1990, Cooke i sur. 2000) te protokol prema Grünwald i sur. (2011). Izolati su identificirani usporedbom dobivenih sekvenci s postojećima u bazi gena NCBI GenBank primjenom algoritma BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).