DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 55 <-- 55 --> PDF |
Sum. list 104:233, 1980. NEKI PROBLEMI ANALIZE MIKROFLORE ŠUMSKIH I DRUGIH TALA DILUCIONUM METODOM NA AGARIZIRANIM SUPSTRATIMA Mr MIROSLAV ŠOJAT, dipl. inž. biol. Šumarski institut, Jastrebarsko SAŽETAK. Razmatraju se razni problemi usavršavanja dilucione metode, naročito obzirom na šumska tla. To su problemi uzimanja uzoraka, procedure i standardizacije metodike, te interpretacije rezultata. Ukazano je na praktičnu korist dilucione metode, posebno kod procjene plodnosti tla. UVOD Za istraživanje broja mikroorganizama u tlu, indirektne metode mnogo se češće upotrebljavaju od direktnih metoda. Od indirektnih metoda najčešće se upotrebljava diluciona metoda na agrariziranim supstratima. Iako je to jedna stara metoda, njena vrijednost još uvijek je velika. Prema MIŠUSTINU et al (1970) pogrešno bi bilo smatrati da nove metode u mikrobiologiji tla mogu uvijek zamijeniti starije metode. Praksa potvrđuje korisnost dilucione metode, iako je ta metoda mnogo kritizirana. U članku se iznose, obzirom na spomenutu metodu, neke manje poznate stvari ili sasvim nepoznate. Akcent je dat više na šumska nego na agrikulturna tla. Kod šumskih tala indirektne metode bolje su od direktnih, koje se ne mogu izvesti s dovoljno točnosti (JENSEN, 1962. i 1963). Materijal i metodika opi sani su već u prijašnjem članku autora (Šumarski list br. 7—9/1974). Treba dodati da su osim tala u članku spomenutih, istraživanja još i neka agrikulturna tla, te ranker i rendzina Zagrebačke Gore. Osim dubinske inokulacije kadkada je bila primjenjena površinska inokulacija. OPAŽANJA I REZULTATI Uz izvjesne izuzetke zapažanja odnosno rezultati iznose se u općenitom obliku i simplificirano koliko je to bilo moguće. Teoretska istraživanja vršena su uz pomoć obilne literature. Uzorci Od dobrog uzimanja uzoraka mnogo ovisi točnost i upotrebljivost rezultata dobivenih s dilucionom metodom. Obzirom na ekološke prilike koje |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 56 <-- 56 --> PDF |
vladaju u prirodi i posebno u tlu, postoje periodi s njihovim malim variranjem kroz dulje vrijeme i periodi kada za relativno kratko vrijeme nastaju velike ekološke promjene. Kod svojih istraživanja mikrobiolog bi trebao obje spomenute varijante uzeti u obzir i uzimati uzorke kada su ekološke prilike stabilnije dulje vrijeme kao i onda kada se u kratkom periodu znatno mijenjaju. Kod uzimanja uzoraka naročito je važan hidro-termički režim tla. Na istraživanom terenu potrebno je u dovoljnom iznosu mjeriti promjene metereoloških prilka. Nekoliko dana prije uzimanja uzoraka njih je potrebno naročito precizno mjeriti, jer se tada i manje promjene mogu reflektirati na brojnost mikroflore tla i njena kvalitativna svojstva. Tada treba uzeti u obzir i takve parametre, koji se kod uobičajenih metereoloških mjerenja obično ne mjere (na pr. vlaga i temperatura tla, insolacija itd.). Ako su dulje vremena metereološke prilike dosta stabilne, onda se spomenuta mjerenja mogu rjeđe vršiti. Kod šumskih tala nagle promjene hidro-termičkog režima česte su na mjestima velike inklinacije terena i južne ekspozicije. To je naročito izraženo ako je uz to još i vegetacija oskudna ili je sklop krošnji slab (13). Dovoljno vremena prije uzimanja uzoraka, trebalo bi uzeti u obzir ne samo promjene vlažnosti i temperature tla i slične parametre, nego i promjene vegetacije, uzgajanih kultura te obavljanje kultivacijskih zahvata (na pr. fertilizacija). Uz uobičajeno uzimanje uzoraka, uzorke bi trebalo uzimati u vrijeme kada su ekološke prilike povoljne za pojedine grupe mikroorganizama. Kadkada za istraživanje mikro-fungalnih populacija uzorke bi trebalo uzimati u vrijeme, kada je tlo optimalne vlažnosti za njihov razvitak, za aktinomicete kada je tlo dovoljno isušeno, a za anaerobe kada je kišni period s obiljem oborina pa je tlo toliko zasićeno s vodom da nastaje nestašica kisika. Na istraživanoj plohi važan je dobar raspored lokaliteta na kojima se uzimaju uzorci ili pod-uzorci za složeni uzorak. Na početku istraživanja mikrobiolog bi trebao ustanoviti koliko je tlo homogeno odnosno heterogeno u horizontalnom i vertikalnom pogledu, jer od toga ovisi broj uzoraka koji treba uzeti. Što je tlo više homogeno, to manje uzoraka treba uzeti. To se može ustanoviti kopanjem profila. Često su istraživanja ograničena na najgornji sloj tla koji ima najviše mikroorganizama. Ustanovio sam, da se tada najbolje iskopati relativno veliki broj malih »profila« (koji nisu duboki) i to na čitavoj plohi. Takve »profile« lagano je prirediti, jer su malih dimenzija (katkada na pr. mogu biti svega 20 cm duboki). Pomoću njih možemo ustanoviti na primjer da li je humusno- akumulativni horizont (koji je u šumskim tlima često relativno tanak) jednolične debljine ili varira obzirom na nju. Broj uzoraka ovisi također i o tome da li vršimo takvo istraživanje kod kojeg se mogu dosta pouzdano predvidjeti rezultati ili su rezultati istraživanja teško predvidivi, pa čak i nepredvidivi. Kod šumskih tala važna je i distribucija listinca, naročito kod sastojina koje obiluju njime te na terenim velike inklinacije. U ovom posljednjem slučaju može se desiti da je jedan dio istraživane plohe obilno prekriven s njime, dok je drugi dio plohe potpuno bez njega. |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 57 <-- 57 --> PDF |
Površinsko tlo ne bi se smjelo odbacivati zbog sterilnosti (11, 15), ako je najgornji sloj tla koji je bogat s mikroorganizmima izrazito tanak (čest slučaj kod šumskih tala). To vrijedi naročito onda ako se radi isključivo o kvalitetnim istraživanjima mikroflore. Staklene bočice i polivinil kesice, u koje se odlažu uzorci, moraju imati dovoljno slobodnog prostora za zrak (ne smiju biti sasvim ispunjene sa tlom), tako da je kod transporta i usklađištenja moguća izvjesna respiracija flore i faune tla (ako nismo toliko snizili temperaturu na kojoj držimo uzorke, da je respiracija otsutna). Raspoloživi kisik inače se potroši, pa dio mikrobne populacije može stradati. Kada se uzorci transportiraju i uskladište, moguće su u njima izvjesne nepoželjne mikrobiološke promjene, pri kojima se broj mikroorganizama smanjuje ili povećava, ugibaju neke fiziološke i taksonomske grupe mikroorganizama, a potencijalna mikroflora i mikrofauna može se aktivirati. Nastaje redistribucija vode tla, volatilne tvari ishlapljuju i narušava se dinamički mikrobiološki ekvilibrijum tla. Za sve gore opisane pojave dao sam jedan zajednički naziv: »mikrobiološka degradacija tla«. Kod raznih tala mikrobiološka degradacija može biti raznolika. Kadkada je jedva primjetljiva ili je otsutna. Degradacija uzorka to je veća što je aktivnija mikroflora i mikrofauna. Držanjem uzoraka na niskoj temperaturi, mikrobiološka degradacija možda se može izbjeći, a gotovo sigurno reducirati. Zbog straha da će neki mikroorganizmi uginuti, neki mikrobiolozi izbjegavaju stavljanje uzoraka na nisku temperaturu (PARKINSON et al., 1971). Ipak izgleda da je bolje držanje tla na temperaturi od + 4<> C, nego u sobnoj temperaturi ili na temperaturi kakva je bila u tlu pri uzimanju uzoraka. Dobar je tretman, ako se temperatura snizi toliko da su svi mikorobiološki procesi znatno usporedni, a da istovremeno mikroorganizmi ne ugibaju mnogo. Ta varijanta nezgodna je zbog kondenzacije vode iz uzoraka na stijenkama polivinil vrećica. Izgleda da je mikrobiološka degradicija otsutna zimi, kada vladaju niske temperature (ako se i uskladištenje vrši pri niskim temperaturama). Također ona može biti otsutna ili reducirana ljeti, kada je tlo potpuno suho, pa su flora i fauna tla inaktivni. Ne slažem se s Parkinsonom et al. (1971) koji tvrde da je mikrobiološka degradacija nevažna kod uzoraka iz kojih se nastoji dobiti mikroorganizme sposobne za proizvodnju korisnih i upotrebljivih antibiotika. Minijaturni pokretljivi mikrobiološki laboratorij bio bi potreban, ako su istraženi tereni vrlo daleko od laboratorija, da se ne troši mnogo ovog vre mena na transport uzoraka pri čemu se uz postojeće tretmane oni mogu znatno promijeniti u mikrobiološkom pogledu. Prije početka analize trebalo bi dati opis boje, vlage, strukture i kon zistencije uzoraka kao i broj korijenja i njegovu biomasu u uzorcima. Ako je tamnija boja, treba ustanoviti da li potječe od humusa ili od mineralnih dijelova tla. Primjetio sam da su spomenuti parametri često u korelaciji s brojevima mikroorganizama dobivenim dilucionom metodom. Ako imamo vi še uzoraka i izvjesna prijašnja iskustva (naročito ako su neki uzorci već ana lizirani), moguće je na komparativnoj osnovi kadkada dosta dobro predvidje ti brojeve koji se kasnije dilucionom metodom precizno utvrđuju. |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 58 <-- 58 --> PDF |
Po s tup a k Filamentozne mikrorganizme oštećuje i uništava prosijavanje tla kroz sita (1, 9, 15), tretman u tarioniku d dugotrajno intenzivno mućkanje suspenzije. Smatram da često ne bi trebala homogenizacija tla prosijavanjem kroz sito. To naročito vrijedi za neka šumska bezstrukturna tla i za tla čiji su agregati pretežno znatnih dimenzija. Najbolje je ako se tlo može disocirati bez tarionika, jer se tada hife i druge mikrobne strukture manje oštete. Ako treba tarionik, onda nastojati da se tlo što manje i što nježnije drobi i pritišće, često se šumska tla teže disociraju od agrikulturnih pa je kod njih potrebno više usitnjavanja uzoraka u tarioniku (uz razne iznimke). Posebni problem kod homogenizacije složenog uzorka, a prije uzimanja odvage, pretstavljaju bezstrukturna tla s velikim postotkom vlage i s jakom kohezijom. To sam opazio kod nekih šumskih tala. U literaturi nisam mogao naći dovoljno podataka za rješavanje toga problema. Što se tlo teže disocira, bit će potrebno više tretmana za disocijaciju, pa će filamentozni, a ponešto i drugi mikroorganizmi biti više oštećeni. Tlo koje je u prirodi u kišnom periodu izloženo dugotrajnom močenju s vodom lakše se disocira, pa se to vjerojatno može odraziti na rezultate. Bakterije, jer su malih dimenzija, bolje podnose procedure disocijacije nego drugi, veći, mikroorganizmi. Zato bi možda trebalo posebno (barem kadkada) prirediti suspenziju za bakterije, a posebno za mikro-Fungi i druge filamentozne mikroorganizme. Kod bakterijske suspenzije u skladu s gore iznesenim mogle bi se primijeniti energičnije procedure za disocijaciju, pa bi se dobila veća desorpcija i veće dispergiranje, a kao rezultat toga i veći brojevi bakterija u analiziranim uzorcima. Problem su veće čestice u suspenziji, koje mnogo mikroorganizama sadrže, a već kod manjih razređenja izostaju iz analize. Tu pojavu opazio sam naročito kod šumskih tala. Kod nekih tala, kod kojih čestice tla pokazuju tendenciju da tvore relativno stabilne taloge na dnu epruveta i da se lijepe na njihove stijenke, trebalo bi kod visokih razređenja intenzivno, a možda, i kontinuirano mućkanje. Otvor pipeta od 1 ml treba biti toliko širok da su pipetiranjem zahvaćene kod niskih (IO-1 i IO—2) a i kod viših razreda relativno vejike čestice. To je suprotno ZVJAGINCEVU (1966). Za kvantitativna istraživanja potrebno je pipetirati iz sredine suspenzije. Kod nižih razređenja, kod kojih je suspenzija manje ili više neprozirna, treba na pipete staviti oznake, da bi znali do koje dubine ih treba uroniti. Za kvalitativne analize preporučljivo je pipetiranje iz raznih dubina suspenzije, tako da zahvatimo čestice koje se međusobno razlikuju po dimenzijama i po specifičnoj težini, a vjerovatno i po kvalitativnom sastavu mikroflore. Kad inkubacija ploča dugo traje, treba staviti toliko supstrata da ne nastane njegovo preveliko isušenje. |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 59 <-- 59 --> PDF |
Na agariziranim supstratima kolonije mogu biti vrlo dobro separirane usprkos njihovog velikog broja. U šumskim tlima koja sam istraživao, Bacillus mycoides dosta se često pojavljivao. Na pločama brzo se razvijao, suzbijajući ostale mikroorganizme. Ploče, na kojima se razvijao, morale su se najčešće odbaciti. On bi mogao imati u šumskim tlima neku značajnu ulogu, ako je i in situ tako čest i u kompeticiji s drugim mikroorganizmima se tako brzo razvija kao in vitro. Na primjeru spomenute bakterije jasno se postavlja pitanje: da li se mikroorganizam, koji se obilno razvija in vitro, isto tako razvija u tlu? Može se desiti da se neki mikrorganizam obilno i intenzivno razvija in vitro, a slabo in situ. I obrnuto je moguće. Tu se opaža jedan od nedostataka diluaione metode. Na selektivnom supstratu za Azotobacter, kod analize nekih šumskih tala, pojavio se osim Azotobacter-a i veliki broj kolonija oligonitrofilnih mikroorganizama. To bi moglo biti od važnosti za poznavanje ne-simbiotske azoto-fiksacije na terenima oskudnim sa biološki aktivnim dušikom (naročito u šumskim fitocenozama koje nisu fertilizacijski tretirane). Kod vlastitih analiza šumskih tala, površinska inokulacija supstrata pokazala se više nepreciznom nego što je to u literaturi akcentuirano, od dubinske inokulacije. Za aktinomicete trebala bi i dubinska i površinska inokulacija. Kod površinske inokulacije aktinomiceti obilno se razvijaju i pristupačni su za determinaciju više nego kod dubinske inokulacije. Standardizacija Mnogo se raspravljalo o tome da li je standardizacija dilucione metode moguća i potrebna. PARKINSON et al. (1971) smatraju da treba odbaciti krutu standardizaciju i zalažu se da se posebno za svaki istraživani teren ustanovi optimalna metodika s kojim bi se onda trebalo služiti. IpakJ previše je skupo utvrditi optimalnu metodiku za svaku istraživanu plohu, pa se njihovi stavovi mogu realizirati samo uz velike teškoće. Zasada izvjesni standardi postoje i to za pojedine dijelove procedure (dezagregacija, pipetiranje, supstrati, inkubacijska temperatura i trajanje inkubacije itd.). Sa standardizacijom (u klasičnom smislu) (6) moguće su izvjesne griješke, ali bez nje one su još veće (kakvo je stanje u današnje vrijeme), tako da su rezultati još manje usporedljivi. Gornje vrijedi kad su nepoznate optimalne metode obzirom na istraživano tlo, a mikrobiolog radi bez dovoljno opravdanja, na svoj način. Standardizacija ipak je izgleda moguća, ali samo unutar određenog tipa tla i određene regije te za određenu grupu mikroorganizama. Izvjesna posebna standardizacija možda kadkada treba unutar pojedine vrste tla obzirom na klimu, vegetaciju.kultivacijske tretmane, dubinu i strukturu tla itd. |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 60 <-- 60 --> PDF |
Ako je moguće, trebalo bi ustanoviti koeficijente, pomoću kojih bi se rezultati dobiveni jednom varijantom dilucione metode mogli barem aproksimativno preračunati u rezultate dobivene drugom varijantom iste metode. Treba istaći da kadkada s različitim varijantama dilucione metode možemo dobiti slične rezultate, pa čak i kod regija koje su znatno udaljfene jedna od druge. Na primjer MIŠUSTIN (1970) u podzolima SSSR-a dobio je 970.000 bakterija u 1 g tla, a ŠOJAT (1974) našao je kod Zalesine, također u podzolu, 1,100.000 bakterija u 1 g tla. DISKUSIJA Pomoću dilucione metode moguće je odrediti brojnost mikroorganizama, a na osnovu toga aproksimativno i biomasu. Smatram da nije važna samo biomasa, nego i ukupna površina mikroorganizama. Od toga ovise takvi procesi kao što je na pr. razgradnja organske tvari. Kod mnogih mikrobioloških istraživanja, trebalo bi komparativno istraživati rizosferno i ne-rizosferno tio. Za tu svrhu potrebno je na eksperimentalnoj plohi imati jedan relativno mali dio bez korijena. To se može postići ili tako da se biljke ne uzgajaju na tom dijelu površine ili ukljanjanjem korijenja na spomenutom dijelu. Iz radova mnogih mikrobiologa nije jasno da li su istraživali rizosferno ili ne-rizosferno tlo. Vrlo malo radova ima sa komparacijama rizosfernog i ne-rizosfernog tla. Kod izračunavanja broja mikroorganizama u 1 g tla trebalo bi uzeti u obzir na neki način i specifičnu težinu istraživanog tla. Jedan gram humusnog tla ima sasvim različit volumen i zato više mikrolokaliteta za razvitak mikroorganizama od 1 grama mineralnog tla. Na to su već davno upozorili neki mikrobiolozi, ali je to palo u zaborav. Svako razređenje opterećeno je sa izvjesnom proceduralnom greškom, specifičnom za to razređenje. Zato uz rezultate treba navesti kojim su razređenjem dobiveni (4). Nalazi dobiveni dilucionom metodom i uz najbolju primjenjenu varijantu ovisit će u izvjesnom stupnju o fizikalnim, kemijskim, i biološkim svojstvima tla, jer o tim svojstvima ovisi kakvo će biti preživljavanje mikroorganizama u tlu prije analize, njihova desorpcija i iznos oštećenja za vrijeme analize, te stupanj dezagregacije istraživanog tla. Uz iste ili slične brojeve mikroorganizama, nalaz je tim značajniji, što je tlo lošijih fizikalno-kemijskih i bioloških svojstava. Jedan milion bakterija u 1 gramu glinovitog tla mnogo je većeg značenja nego isti ili sličan broj bakterija u 1 gramu humusnog tla. Humusa može biti mnogo zato jer ima mnogo mikroorganizama, ali može biti i obrnuto: mikroorganizama može biti mnogo, jer ima mnogo humusa. To posljednje vrijedi naročito onda kad su periodi stagnacije mi |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 61 <-- 61 --> PDF |
kroflore i mikrofaune tla, jer u periodima sa nepovoljnim uvjetima humus može povoljno djelovati na preživaljavanje mikroorganizama. Budući da se dilucionom metodom broje i oni mikroorganizmi, koji se u prirodi nalaze u dormantnom stanju, mi ne možemo dovoljno dobro opažati smanjenje aktivnosti mikroorganizama. Ako se uzorci uzimaju mali broj puta godišnje, onda uzimanje u obzir i dormantnih mikroorganizama može biti čak poželjno. Opazio sam da ako ima više pripadnika jedne taksonomske grupe (na pr. bakterija), onda obično ima i više pripadnika drugih taksonomskih grupa (gljivice i aktinomiceta). Rezultati su zanimljivi, ako nađemo nepravilnosti obzirom na spomenuto. Kod dilucione metode pojavljuju se posebni problemi kod filamentoznih mikroorganizama i to naročito kod fungalne populacije, ali i kod aktinomiceta, pa čak i kod algi. Problemi se odnose ne samo obzirom na njihovu filamentoznu prirodu, nego i obzirom na spore koje stvaraju. Prema WARCUP-u (1955, 1957) kod njegovih istraživanja svega 5% kolonija nastalo je od hifa, 75% nastalo je od spora, a za ostale nije mogao utvrditi porijeklo. Općenito se uzima da su brojevi spora odraz broja hifa i hifalne aktivnosti u tlu. Ipak ima mnogo faktora koji takvo stanovište prave u izvjesnom iznosu nepouzdanim (16). Dobiveni brojevi mogu biti odraz broja hifa u prošlosti ili u vrijeme vršenja analize ili oboje. Ako su spore odraz fungalne aktivnosti, mi ne možemo znati da li je to odraz aktivnosti od prije mjesec dana ili od prije svega 2—3 dana ili je to odraz aktivnosti od onog dana kad vršimo analizu. Količinu spora kao odraz prijašnje hifalne aktivnosti treba utvrđivati pomoću analiza u kratkim vremenskim razmacima. Inače čim su razmaci veći tim se više gubi spomenuti odraz, jer ga modificiraju promijene ekoloških prilika, a nepoznavanje dugotrajnosti spora u tlu i iznosa sporulacije još više otežavaju naše procjene s obzirom na gornje. Ako sa Rossi-Holodni ili Jones-Millison metodom ili sa »soil sections« nađemo relativno malen broj hifa, a sa dilucionom metodom dobijemo visoke brojeve micro-Fungi, onda to može značiti da u tom slučaju dominiraju spore koje su više ili manje odraz nekog prijašnjeg broja hifa, a ne recentnog stanja. Broj spora znatno ovisi ne samo o količini hifa nego i o količini fruktifikacija, o kojima in situ mi vrlo malo znamo. Mi ne znamo dovoljno precizno kakvi ekološki faktori stimuliraju odnosno inhibiraju tvorbu fruktifikacija u tlu. Broj spora dakle nije samo odraz količine i aktivnosti hifa, nego i odraz količine fruktifikacija i njihovog razvitka u prirodi. Između hifa i spora imamo jedno slabo izraženo područje — područje fruktifikacija, zbog kojeg odraz hifalne biomase i aktivnosti može kadkada biti znatno modificiran. Preciznije je dakle ako tvrdimo da je broj fruktifikacija (uz iznimke) ovisan o broju hifa, a broj spora da je odraz broja i vrsta fungalnih fruktifikacija. Spore se akumuliraju ako dh u tlu više nastaje nego što ih ugiba. Tu je važan životni vijek spora ( često nam je nepoznat, jer ovisi o većem bro |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 62 <-- 62 --> PDF |
ju faktora: o tome kojoj vrsti gljiva spore pripadaju, o ekološkim faktorima, o rezistentnosti spora na nepovoljne uvjete itd.) i zastupljenost obilno sporulirajućih vrsta i rodova mikro-Fungi. Akumulacija će biti tim veća, što je dulji životni vijek spora i što više ima obilno sporulirajućih rodova i vrsta. Za dobru interpretaciju rezultata moramo uz ostalo uzeti u obzir i akumulaciju spora. Ako se broj spora smanjuje, to ne znači uvijek da ih više ugiba, nego može značiti da je zbog nepovoljnih ekoloških faktora obustavljena tvorba fruktifikacija. što je broj obilno sporulirajućih vrsta veći, tim će dobiveni brojevi biti više odraz broja fruktifikacija nego broja hifa. Kadkada imamo posebno hifalni period, koji obiluje hifama, a ima malo fruktifikacija. Nakon toga je period obilnog sporuliranja. Ako analizu vršimo u prvom periodu, ne će se opaziti obilje hifa, a u drugom periodu dobit ćemo visoke brojeve koji nisu u skladu sa recentnim brojem hifa. To otežava interpretaciju. Na osnovi broja spora mi ne možemo saznati trajanje hifalnog perioda, a prema tome niti ukupni iznos fungalne aktivnosti u tlu. Brojevi spora često su indikator koliko su ekološke prilike povoljne odnosno nepovoljne ne samo za spore nego i za razne druge fungalne strukture, na pr. za hife. Zato se na temelju broja spora često može procijeniti ne samo prijašnji nego i recentni broj hifa (u momentu analize). Kadkada ekološki faktori mogu dobro djelovati na sporulaciju i na spore, a loše na hifalne strukture i obratno. To je važno onda kada po sporama želimo prosuditi ne samo prijašnju nego i recentnu hifalnu populaciju. Ako su ekološki uvjeti dobri za sporulaciju ili za preživaljavanje spora (kadkada za oboje), može nastati znatna akumulacija spora. Onda su »brojevi micro-Fungi« visoki, pa se pogrešno zaključuje da su hife obilno zastupane. Spomenuto se može odnositi na prošlo ili na recentno stanje fungalnih populacija odnosno na oboje. Povećanje broja spora može biti direktno, time što recentni ekološki faktori povoljno djeluju na spore, a može biti i indirektno: uzrokovano kao rezultat povećanja broja fruktifikacija. Smanjenje broja spora također može biti direktno pod utjecajem ekoloških faktora loših za spore ili indirektno kao posljedica smanjenja broja fruktifikacija. Brojeve kolonija koje potječu od obilno sporujirajućih vrsta micro-Fungi, trebalo bi podesnim korekcionim koeficijentima smanjiti. Na pr. 20 kolonija od Penicillium sp. trebalo bi brojati kao jednu koloniju. Da bi mogli dobro interpretirati rezultate dobivene dilucionom metodom, trebali bi znati vremenski razmak između perioda najobilnije sporulacije i uzimanja uzoraka za analizu. Kadkada možemo uzimati uzorke baš u vrijeme najobilnije sporulacije, pa je tada spomenuti period jednak nuli. Što češće vršimo analize na istraživanoj plohi, su manji problemi: koliko je vremena prošlo od najobilnije sporulacije, koliko je preživaljavanje spora, kada su ustanovljene spore nastale, koliko je ugibanje, rezistentnost i akumulacija spora itd. 240 |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 63 <-- 63 --> PDF |
Osnivanje dilucione metode pretežno na sporama filamentoznih mikroorganizama ima tu dobru stranu, da se spore ne uništavaju procesima dezagregacije uzoraka i raznim drugim zahvatima toliko kao filament!. Na taj način reduciran je utjecaj variranja fragmentacije filamenata na konačne rezultate. Obzirom na to da dilucionom metodom pretežno mjerimo spore micro- Fungi i aktinomiceta, imamo mnogo manje fluktuacija brojeva tih mikroorganizama, nego kad bi mjerili isključivo filamente, jer su spore otpornije na loše životne uvjete, pa oni na njih manje djeluju. Uz uvjet da su svi ostali faktori isti,, — što su spore rezistentnije, tim su manje izražene oscilacije brojeva. Diluciona metoda nije naročito podesna za procjenjivanje aktivnosti mikroorganizama. To vidimo po tome na pr., da znatan broj spora nalazimo u tlu u periodima totalne ne-aktivnosti mikroflore (zima i suho tlo u toplom dijelu godine). Na osnovu nalaza dobivenih dilucionom metodom teško je predvidjeti budućnost fungalne populacije, jer razvitak mikroflore tla ovisi od mnogo faktora (na pr. od ekoloških uvjeta koje je najčešće teško predvidjeti, o pojavi mycostasis-a itd.). Razmatranja o mikro-fungalnoj populaciji mogu se barem djelomično aplicirati na druge filamentozne pretstavnike mikro-flore tla, pa čak i na one ne-filamentozne. Primjer za ovo posljednje je ovaj: što je veća rezistentnost bakterija na loše ekološke uvjete ili ako klima i tlo odgovaraju više za njihovo preživljavanje nakon perioda aktivnosti, — njihov broj će biti veći. Poznavanje brojnosti ukupne mikroflore, te njenih fizioloških i taksonomskih grupa, koje nam omogućava diluciona metoda na agariziranim supstratima, važno je i korisno iz više razloga. Naša poznavanja mikrobioloških procesa i stanja tako se povećavaju. O tome je već pisano u ovom časopisu (ŠOJAT, 1974). Uz ostale metode, diluciona je naročito važna za proučavanje i procjenjivanje plodnosti tla. Treba spomenuti da za plodnost tla nije važna samo mikroflora, nego i mikrofauna, te čitav niz drugih faktora. Veliki broj mikroorganizama u trenutku analize ne mora značiti da je i plodnost tla velika, nego može ukazivati na obilje organske tvari, koja je potrebna za razvitak mikroorganizama. Ako je zbog obilja organske tvari velika brojnost mikroflore, to se na plodnost tla može odraziti tek znatno kasnije, nakon mineralizacije te tvari. Za to treba kadkada i nekoliko godina. Zbog obilja mikroorganizama, tlo može biti plodno, ali moguće je i obrnuto: zbog toga što je tlo plodno — razvio se veliki broj mikroorganizama. Uz izvjesne iznimke bilo bi ne-ekonomično i previšeskupo poduzimati agrikulturne i silvikulturne mjere isključivo zbog reguliranja mikro-flore i mikro-faune. Međutim, moguće su izvjesne modifikacije spomenutih tretmana koje bi stimulirale odnosno odgovarale mikrobnim populacijama tla 241 |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 64 <-- 64 --> PDF |
bez nekih posebnih izdataka (na pr. modifikacija količine i vremena fertilizacije tla). Diluciona metoda često je korištena, ali još uvijek ima izvjesnih nedostataka, koje je moguće u znatnom iznosu ukloniti i njenu točnost tako povećati. Time bi se poboljšalo naše poznavanje kompleksnih mikro-populacija tla, naročito u kvantitativnom pogledu. ZAKLJUČCI Uzevši u obzir iznesena zapažanja i postignute rezultate u vlastitoj primjeni dilucione metode, može se zaključiti: 1. Diluciona metoda još uvijek ima svoju vrijednost, iako se već vrlo dugo vremena upotrebljava. 2. Što se više približava vrijeme uzimanja uzoraka, tim preciznije treba pratiti promjene ekoloških faktora, naročito hidrotermičkog režima tla. 3. Prije uzimanja uzoraka treba se dobro upoznati sa heterogenosti istraživane plohe kako u vertikalno, tako i horizontalnom pogledu. Od toga ovisi koliko će se uzoraka uzeti. 4. Kadkad se uzorci uzimaju posebno za pojedine taksonomske i fiziološke grupe mikroorganizama. 5. Transport i uskladištenje uzoraka najbolje je vršiti na sniženoj temperaturi. 6. Kod disocijacije tla, mora se na minimum reducirati tretmane koji mogu oštetiti mikroorganizme. To se naročito odnosi i filamentozne mikroorganizme. 7. Izgleda da postoje značajne razlike između razvitka mikroorganizama in situ (u prirodi) i onog in vitro. 8. Površinska inokulacija može biti znatno nepreciznija od dubinske inokulacije. 9. Kod mikro-Fungi i kod aktinomiceta, spore su više odraz broja fruktifikacija u tlu (a o kojima malo znamo), nego odraz broja filamenata. 10. Razmotreni su razni problemi koji nastaju zbog toga što se neki mikroorganizmi pojavljuju u tlu i u obliku spora i u obliku filamenata. 11. Diluciona metoda od znatne je praktične važnosti za istraživanje mikrobioloških procesa i stanja u tlu, za reguliranje i valorizaciju plodnosti tla i za razna druga istraživanja. LITERATURA 1. Jensen , V. (1962): Studies on the microflora of Danish beech forest soils. I, The dilution plate count technique for the enumeration of bacteria and fungi in soil, Zbl. II, B. 116, H. 1, 13—32. |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 65 <-- 65 --> PDF |
2. Jensen , R. (1963): II. Numbers of Microorganismus, as determined by plate Counts, Zbl. II, B. 116, H. 4, 348—471. 3. Jensen , R. (1963): V. The micro-Fungi, Zbl. II, B. 117, H. 2, 167—177. 4. K r a s i 1 j n i k o v, N. A. ed. (1970): Mikroorganizmi v seljskom hozjajstve, Moskva. 5. Mišustin, E. N. i V. T. Emcev (1970): Mikrobiologija, Moskva. 6. M o d r i ć, A. i St run jak, R. (1966): Metode za određivanje broja mikroorganizama u zemljištu, u knjizi »Mikrobiološke metode ispitivanja zemljišta i voda«, Beograd, 27—31. 7. Parkinson, D., T. R. G. Gray, S. T. Williams (1971): Methods for Studyng the Ecology of Soil Micro-organisms. Oxford. 8. Parkinson , A., et al. (1971): Heterotrophic Microflora. U knjizi: Methods of Study in Quantitative of Soil Ecology, ed. J. Phillipson, London. 9. Pochon , J. (1955): Technique de preparation des suspensions-dilutions de terre pour analyse microbiologique. Annales de Tlnstitut Pasteur, T. 89, No 4, 464—467. 10. Pochon , J. i H. De B a r j a c, (1958): Traite de Microbiologie des Sols. Paris, 46—47. 11. Pochon , J. i P. Tardieu x (1962): Techniques d´analyse en microbiologic du sol. Paris, 9—13. 12. Russell , E. J. (1970): The world of the soil. London. 96—99. 13. Š o j a t, M. (1970): Proučavanje gljiva u tlu primjenom raznih mikrobioloških metoda. Magistarski rad, Zagreb, 1—50. 14. Š o j a t, M. (1974): Mikrobiološka istraživanja tala nekih šumskih ekosistema u Hrvatskoj. Šumarski list, br. 7—9, Zagreb. 15. V o j i n o v i ć, Ž. (1966): Opšti postupci za mikrobiološko ispitivanje zemljišta. U knjizi: Mikrobiološke metode ispitivanja zemljišta i voda, ed. Ž. Tešić i M. Todorović. Beograd, 7—20. 16. V o s t r o v, I. S. i A. N. Petrov a (1961): Opredeljenije biologičeskoj aktivnosti počvi različnimi metodami. Mikrobiologija, tom XXX, vip 4, 665—672. 17. War cup, J. H. (1977): Fungi in soil. U knjizi: Soil Biology, ed. A. Burges i F. Raw. London, 51—111. 18. Zvjagincev , D. T. (1966): Metodi obnaruženija i ikoličestvenova učjota počvenih mikroorganizmov, u knjizi: Metodi izučenija počvenih mikroorganizmov i ih metobolitiv, ed. Krasiljnikov, N. A. Moskva, 4—47. Some Problems of the Microflora Analysis of the Forest and Other Soils by Use of Dilution Method on the Agar Substrates Summary The dilution method has retained its value although used for a long time. Prior to sampling it is important ta take notice of changes of ecological data, especially of the hydrothermic regime. It is also necessary to study the heterogenous nature of soil. Transportation and storage of samples should be done at reduced temperature. During analysis the damage of the philamentous microorganisms should be minized The surface plating inoculation is less accurate |
| ŠUMARSKI LIST 5-6/1980 str. 66 <-- 66 --> PDF |
than pour plate method which is understressed in literature Discussed are the differeent problems arisen through the fact that some micro-organisms appear both in form of spores and filaments The delution method is of considerable practical value for the research work on the microbiological processes and conditions of soils, for regulating and valorizing the soil fertility as well as for ether reserarch investigations. Primljeno 10. Ill 1980. »U vezi s problemima proizvodnosti šumskih tala, zanimiva su i razmatranja o pripremi tla za intenzivnu proizvodnju. SOLJANIK (1952) je mišljenja da prethodna obrada zemljišta za umjetno pošumljavanje stvara povoljna pedološka i mikrobiološka svojstva. MEŠTROVIĆ (1964) prenosi strana iskustva o mehaničkoj obradi tala pri pošumljavanju u Mediteranu, a MARTINOV1Ć (1965) ukazuje na potrebu da mehanička obrada tala treba uvažavati ekonomiziranje humusom i drugim činiteljima plodnosti tala«. (POVIJEST ŠUMARSTVA HRVATSKE 1846 — 1976 kroz stranice Šumarskog lista — izdao Savez ITŠDI Hrvatske, Zagreb, 1976, str. 55) |