DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 3-4/2002 str. 43 <-- 43 --> PDF |
N. Juretić, M. Šeruga, D. Škorić: FITOPLAZMATSKE BOLESTI ŠUMSKOG DRVEĆA Šumarski list br. 3-4, CXXVI (2002), 155-163 ma je i u tome što biljne fitoplazme dolaze unutar stanice domaćina (intracelularno), dok mikoplazme dolaze izvan stanica domaćina (ekstracelularno). Razlika je i u načinu prijenosa u prirodi: dok se mikoplazme prenose probavnim traktom, fitoplazme se rasprostranjuju u prirodi različitim vrstama člankonožaca, u prvom redu nekim kukcima koji se hrane biljnim sokom (Tsai 1979). Značajna je razlika između miko plazma i fitoplazma i u tome što se mikoplazme mogu, a fitoplazme ne mogu kultivirati in vitro, npr. na agarskoj podlozi, pa otuda i velike teškoće u istraživanju fitoplazma. Fitoplazme uzrokuju različite bolesti i na zeljastim i na drvenastim biljkama. Najčešće u biljkama ti mikroorganizmi okupiraju provodne elemente, osobito floem. KAKO SE FITOPLAZME OTKRIVAJU U BILJKAMA? Methods in phytoplasma detection Razvijeni su različiti postupci kojima se fitoplazme detektiraju. Ti se izuzetno sitni mikroorganizmi mogu u biljci otkriti elektronskomikroskopskom analizom ultratankih presjeka floemskog tkiva (si. 1). Fitoplazmatsku zarazu moguće je utvrditi i fluorescentnim mikroskopom: presjeci floemskog tkiva obraduju se fluorescentnim bojama koje se vežu na fitoplazmatsku DNA; pod utjecajem UV-zraka te boje fluoresciraju prepoznatljivom svjetlošću. U tu svrhu najčešće se koristi tzv. DAPI-test, u kojem se kao boja koristi 4´, 6-diamidin-2-fenilindol 2 HC1. Pod utjecajem UVzraka obojena fitoplazmatska DNA se u sitastim cijevima vidi u obliku plavobijelih nakupina (Sinclair i sur. 1996). Razlikovanje pojedinih fitoplazma i njihova klasifikacija osnivala se ranije na specifičnom prijenosu vektorima, krugu domaćina i na osnovi karakterističnih simptoma na nekim domaćinskim biljkama. No, prije desetak godina u detekciju i identifikaciju fitoplazmatskih bolesti uvedene su molekularne tehnike. Načelno, tim se tehnikama otkrivaju i uspoređuju geni koji su zajednički različitim fitoplazmama (konzervirani geni). Najčešće se otkriva i uspoređuje fitoplazmatski gen koji kodira 16 S ribosomsku RNA. Taj gen imaju sve fitoplazme, ali stoje važno nemaju ga biljke (Seemiiller i sur. 1994; Lee i sur. 1993). Najprije se lančanom reakcijom polimeraze (metoda PCR) uz korištenje specifičnih početnica umnožava (amplificira) nukleotidni slijed koji kodira 16 S ribosomsku RNA. Kad se dobije u zadovoljavajućim količinama, nukleotidni slijed (gen) analizira se tako, da se specifičnom endonukleazom cijepa na manje segmente. Karakteristično je da će se gen jedne fitoplazme pod utjecajem određene endonukleaze cijepati na posve određeni broj segmenata koji će biti različitih, ali posve određenih duljina. Nakon cijepanja endonukleazom, dobiveni nukleotidni segmenti se separiraju gel-elektroforezom te se analizira njihov polimorfizam (tzv. metoda RFLP). Ako se u elektroforezi usporede nukleotidni segmenti npr. dviju fitoplazma koje pripadaju dvjema različitim fitoplazmatskim skupinama, vi djet će se da one imaju različite RFLP-profile, tj. razlikovat će se po elektroforetskim vrpcama (si. 2). SI. 2. Razlikovanje (identifikacija) fitoplazma pomoću elektroforeze, i to na osnovi utvrđivanja različitih dužina fragmenata gena za 16S rRNA koji su dobiveni cijepanjem istim restrikcijskini enzimom. (S - kontrola, A, B, C, D - istraživani uzorci, bp - parovi baza). Fig. 2. Differetiation of phytoplasmas based on restriction fragment length polymorphisms of the 16S ribosomal RNA gene; this gene (DNA) was amplified by polymerase chain reaction (using specific primers) and digested by restriction endonucleases. DNA bands were separated by acrylamid gel electrophoresis. (S - control phytoplasma, A, B, C, D samples of investigated phytoplasmas, bp - base pairs). |