DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 55 <-- 55 --> PDF |
IZVORNI ZNANSTVENI ČLANCI - ORIGINAL SCIENTIFIC PAPERS Šumarski list br. 11-12, CXXVIII (2004), 649-654 UDK 630* 165 (001) VARIJABILNOST MIKROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE {Prunus avium L.) IZ SREDIŠNJE BOSNE MICROSATELL1TE DNA VARIABILITY OF POPULATIONS OF WILD CHERRY (Prunus Avium L.) FROM CENTRAL BOSNIA Dalibor BALLIAN´ SAŽETAK: U raduje istraživana mikrosatelitna DNK varijabilnost populacija divlje trešnje (Prunus avium L.) iz središnje Bosne (Mrkoviči, Ilijaš i Kakanj), a za kontrolu je iskorištena domaća sorta trešnje (cv. Alica). Za ekstrakciju DNK korištena je modificirana Roger s-ova (1997) procedura za ekstrakciju genomske DNK iz embriona. Genetička varijabilnost populacija procijenjena je uz pomoć visoko ponavljajućih DNK molekula (simple sequence repeats - SSR). Potvrđeni su rezultati ranijih istraživanja u kojima je registrirana relativno mala genetička varijabilnost trešnje (Prunus avium L.), uz korištenje određene grupe mikrosatelita. Ključne riječi: Prunus avium L., DNK, ekstrakcija, mikrosateliti. UVOD U suvremenim istraživanjima polimorfizma, kod eha i Strossera (1997, 1998), Gerlacha i sur. vrsta šumskog drveća, sve značajnije mjesto zauzima (1998). Medu tim radovima interesantan je rad koji se analiza varijabilnosti molekule DNK. Ova suvremena bavi mogućnostima rane selekcije kultivara trešnje, od metoda analize doprinosi novim spoznajama u sisteHormaz a (1999). Značajni su i drugi radovi koji se matici biljaka. Dolazi se do novih spoznaja, na temelju odnose na pitanja osnovnih fundamentalnih istraživakojih se pretpostavlja da će stara shvaćanja o vrstama nja kod raznih vrsta drveća, a između ostalog i roda biti revidirana i da će mnoge opisane vrste dobiti status Prunus, a odnose se djelomično na divlju i domaću podvrsta, varijeteta ili ekotipova. trešnju (Iezzoni i sur. 1996, Levi i sur. 1993, Ma lusa 1993, Malusa iMarchesini 1993, Malu- Molekularne metode do sada su našle daleko veću sa iSansavini 1993 i 1995). primjenu u poljoprivredi nego u šumarstvu. Ipak ima mnogo istraživanja na šumskim vrstama drveća, poseCilj rada bio je procijeniti stupanj unutarpopulacijbice hrastovima, jasenima, bukvi, crnom boru, itd. Na ske i međupopulacijske varijabilnosti divlje trešnje u razini Europe pokrenut je čitav niz značajnih projekata središnjoj Bosni, te ove rezultate usporediti s rezultatiu cilju izučavanja DNK, kartiranja gena kod ekonomma koji su do sada publicirani. Djelomična usporedba ski značajnih vrsta drveća. može se izvršiti s radom C i p r i a n i j a i sur. (1999). Do sada provedena istraživanja na DNK divlje trešDobiveni rezultati omogućili bi da se uoče razlike nje (Prunus avium L.) objavljena su u više radova o između populacija, te da se utvrdi da li se divlja trešnja ekstrakciji DNK (Saiki 1990, Lefort i Douglas značajno razlikuje na molekularnom razini od domaće 1999). Ostala istraživanja koja su tretirala DNK trešsorte trešnje koja je najzatupljenija u području istražinje, odnose se na domaće sorte trešanja značajne u vovanih populacija. Rezultati bi nas usmjerili na pravi ćarskoj proizvodnji, te su najznačajniji radovi Gerla -put iznalaženja optimalne metode za determinaciju čiste divlje trešnje, te olakšalo poslove na očuvanju ge netičke raznolikosti ove vrste. Dr. se. Dalibor Ballian, Šumarski fakultet u Sarajevu |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 56 <-- 56 --> PDF |
D. Ballian: VARIJABILNOST MIKROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE , Šumarski list br. 11-12, CXXVII1 (2004), 649-654 MATERIJAL I METODA RADA Tijekom 1999. godine sakupljeno je sjeme divlje trešnje iz tri populacije na području središnje Bosne. Populacije se nalaze u različitim ekološkim nišama, a udaljene su jedna od druge 30 km. Sjeme je sakupljeno sa 69 stabala (populacija Mrkoviči 31 stablo, Ilijaš 15, Kakanj 23), a za kontrolu je korišteno sjeme ubrano s jednog stabla domaće trešnje, poznate autohtone sorte "Alica". Inače, ova je sorta najviše zastupljena u voćnjacima gornjeg i srednjeg toka rijeke Bosne, gdje je i sabiran materijal za istraživanje. Fenologija cvjetanja kultivara poklapa se sa cvjetanjem divlje trešnje, kao i vrijeme sazrijevanja plodova. Za ekstrakciju DNK korišten je embrij koji je izvađena iz sjemena mehaničkim putem. Njegova veličina i masa zavisila je od veličine sjemena, a masa se kretala oko 0,0005 g kod divlje trešnje, do 0,0008 g kod domaće trešnje. Za proučavanje unutarpopulacijske varijabilnosti slučajnim izborom uzeta su tri stabla iz populacije Mr Izolacija genomske DNK Izolacija je izvršena za genomsku (cjelokupnu staničnu) DNK (Rogers 1997). Mala veličina embriona otežavala je ekstrakciju, ali je metoda uspješno prilagođena količini embriona u prvim etapama izolacije na način kako slijedi. Embrioni su držani u tubama na temperaturi od -70 °C, najmanje 24 sata. Po njihovom vađenju iz frižidera, odmah je vršena maceracija specijalno konstru PCR-procedura i elektroforetska analiza Korištene su početnice sa 18-22 baze, proizvođača "Genosys biotechnologies - Cambridge (UK)" (Tab. 1.). Unatoč različitim temperaturama nalijeganja (TA) koviči, sa po osam sjemenki (ukupno 24 ekstrakcije), dva stabla iz populacije Ilijaš (16 ekstrakcija) i dva stabla iz populacije Kakanj (16 ekstrakcija). Također je rađena ekstrakcija i za domaću trešnju sorte "Alica" koja je služila kao kontrola, jer je najčešća u području istraživanih populacija (osam ekstrakcija). Za istraživanje međupopulacijske varijabilnosti slučajnim je izborom uzet po jedan embrion od svakog stabla, na kojem je izvršena ekstrakcija (70 ekstrakcija). Po završenoj ekstrakciji za preparate je primijenjena standardna je PCR procedura, a potom analiza na gelu. Varijabilnost između stabala i populacija procijenjena je uz primjenu X2-testa, testiranjem dobivenih distribucija u populacijama. Primjenom Hardy-Wainbergovog zakona izračunat je broj heterozigota u populacijama za sve tri populacije. iranom alatkom, uz dodavanje 2 x CTAB buffera (2 % CTAB, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl) u prilagođenoj količini od 50 ul, što se pokazalo sasvim dovoljnim za veličinu embriona. Sva daljnja procedura odvijala se uz manje preinake Rogersovo g (1997) protokola, prema količini materijala koji je služio za ekstrakciju. Modifikacija je rezultirala dovoljnom količinom DNK na kraju procesa izolacije genomske DNK. u istraživanju je za sve početnice uspješno korištena TA = 58°C. Tablica 1. Osnovni podaci o parovima početnica (Genosys biotechnologies - Cambridge). Table 1 Redni broj No. 1 2 3 4 Basic details of the primers (Genosys biotechnologies -Cambridge). Početnice Primers UDP96-003F UDP96-003R UDP96-018F UDP96-018R UDP97-402F UDP97-402R UDP98-407F UDP98-407R Broj baza Sekvenca (5´-3´) No. of bases Sequence (5´-3´) 20 TTGCTCAAAAGTGTCGTTGC 20 ACACGTAGTGCAACACTGGC 20 TTCTAATCTGGGCTATGGCG 22 GAAGTTCACATTTACGACAGGG 22 TCCCATAACCAAAAAAAACACC 20 TGGAGAAGGGTGGGTACTTG 20 AGCGGCAGGCTAAATATCAA 19 AATCGCCGATCAAAGCAAC TA*=4(#GiC) + 2(#AiT) Temperatura topljenja Melting temperature (Tm) 63,9 63,9 63,8 62,2 63,3 63,8 63,4 65,0 Temperatura nalijeganja Annealing temperature (TA)* 58 62 60 64 60 62 58 56 (#G i C) -ukupan broj baza G i C koje se nalaze u početnici (#A i T) -ukupan broj baza A i T koje se nalaze u početnici |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 57 <-- 57 --> PDF |
D. Ballian: VARIJABILNOST MIKROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE .. Šumarski list br. 11-12, CXXVIII (2004), 649-654 Za PCR djelovanje učinjen je reakcijski volumen od 20ul za par Tablica 2. PCR procedura Table 2 PCR procedure početnica i prikazan u tablici 3, a procedura je trajala kao što je priVrsta temperature Type of the temperature Temperatura Temperature Vrijeme Time Broj krugova No. of circles kazano u tablici 2. početna temperatura 94 °C 2 min Nakon zavšene PCR procedure, razdvajanje PCR produkta izvršeno je elektroforezom na 1,5 % agarnom gelu (Ultra pure DNA grade agarose - Bio Rad). Kako se temperatura denaturacije temperatura hibridizacije temperatura elongacija završna temperatura temperatura čekanja 94 °C 55 °C 72 °C 72°C 4°C 1 min 1 min 1 min 8 min - 35 35 35 radi o specifičnim početnicama, nije bilo potrebe da se radi na poliakridamidnom gelu, Nakon elektroforeze bojenje gela izvršeno je ethi nego su vrpce izbrajane na agarnom gelu. Vrijeme podium bromideu koncentracije od 1 ug/ml, u trajanju od trebno za rad elektroforeze bilo je u zavisnosti od veli20 minuta. Potom je izvršeno snimanje gela i izbrajane čine gela, i kretalo se oko jednog sata pri istosmjernoj vrpci. struji od 50 ili 100V. Tablica 3. PCR standardni protokol Table 3 PCR standard protocol Protokol za broj uzoraka 1 7 11 15 19 21 Broj analiza 1 6 10 13 18 20 u ul U jLll u ul u ul U jLll U jLll H20 9,92 69,44 109,12 148,80 188,48 208,32 10 x Buffer 2,00 14,00 22,00 30,00 38,00 42,00 lOxdNTP´s 2,00 14,00 22,00 30,00 38,00 42,00 Početnica 1 1,00 7,00 11,00 15,00 19,00 21,00 Početnica 2 1,00 7,00 11,00 15,00 19,00 21,00 Taq 0,08 0,56 0,88 1,20 1,52 1,68 Otopina DNA 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 Ukupno 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 REZULTATI ISTRAŽIVANJA I RASPRAVA Istraživanja su pokazala da od četiri para početnica monomorfizam, iako je registrirana u ranijim istraživakoji su korišteni u ovim istraživanjima samo jedan par njima, ali na drugim vrstama iz roda Prunus (P persica pokazuje polimorfizam (Tab. 4.). U drugih parova poL.)( Ciprian i i sur. 1999). četnica nije registrirana varijabilnost, jer su pokazali Tablica 4. Frekvencije alela i heterozigotnost.kod svih uzoraka. Table 4 Frequency of the alels and heterozygosity in all samples Početnice Primers 1 Aleli (bp) Alleles (bp) 2 Heterozigoti Heterozygoty Vrpce Band Broj analiza No. ofanalisys UDP96-003 bp.149 1.00 0 0 Nema polimorfizma Jednostruka 70 UDP96-018 bp.240 1,00 0 0 Nema polimorfizma Jednostruka 70 UDP97-402 bp.139 0,57 bp.151 0,43 0,49 Dvostruka 126 UDP98-407 bp.136 1,00 0 0 Nema polimorfizma Jednostruk 70 bp. - parova baza Iz tih je razloga u ovom istraživanju varijabilnosti dobila očekivana heterozigotnost. Prosječna heterozi- DNK korištena početnica UDP 97-402, kod koje se gotnost za sve populacije iznosi 0,49 (Tab. 4.). Najveću 651 |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 58 <-- 58 --> PDF |
D. Ballian: VARIJABILNOST MIKROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE ... Šumarski list br. 11-12, CXXVIII (2004), 649-654 unutarpopulacijsku heterozigotnost imala je populacija ma, što se može vidjeti iz tablice 6. Najveću heteroziKakanj (0,50), dok najmanju pokazuje populacija Ilijaš gotnost pokazalo je stablo broj 45 i 58 iz populacija (0,48) (Tab. 5,). Ilijaš i Kakanj (0,50). Najmanju heterozigotnost ima stablo broj 18 iz populacije Mrkoviči. Kao što je uočena varijabilnost između populacija, tako je zabilježena i varijabilnost u samim populacijaTablica 5. Dobivene frekvencije alela i njihova heterozigotnost u.populacijama. Table 5 The frequencies of the alleles and heterozygosity in the populations Aleli sa veličinom bp Populacija Broj stabala za analizu Allels with size bp Population No. of trees for the analisys 1 139bp Mrkoviči 31 0,58 Ilijaš 15 0,60 Kakanj 23 0,52 Tablica 6. Frekvencije i heterozigotnost stabala u populacijama. Table 6 Frequencies of the alels and heterozigotry in the trees.alleles Populacija Population Mrkoviči Ilijaš Kakanj Domaća trešnja Broj i šifra stabla Broj analiziranih embriona No. trees No. of trees for the embrion Stablo 1. (8) 8 Stablo 2. (18) 8 Stablo 3. (28) 8 Stablo 1. (38) 8 Stablo 2. (45) 8 Stablo 1. (58) 8 Stablo 2. (68) 8 Stablo 1. (70) 8 Ekološka valencija vrste nasljedna je karakteristika, odnosno njezina je sposobnost prilagodbe određena nasljednom osnovom ili genomom biljke. Pomoću prikazanih genetičkih parametara, razlike između populacija ili unutar populacija obično bivaju vidljive i jasne, ali u ovom slučaju su male. Mogući su uzroci tih malih različitosti, osim prirodne selekcije i antropogena djelovanja te razvojni čimbenici ili procesi prilagođavanja na određene ekološke uvjete. To proizlazi iz činjenice da je područje središnjih Dinarida vrlo specifično kada su posrijedi uvjeti okoliša, jer na vrlo malom prostoru postoji velika varijabilnost klimatskih, edafskih, orografskih i drugih čimbenika koji izravno utječu na diferencijaciju različitih ekotipova. Iako stručnjaci smatraju da vrste šumskog drveća s područja Dinarida pokazuju veliku varijabilnost, u usporedbi s istim vrstama sa sjevera, u slučaju divlje trešnje nismo mogli to zaključiti. Dobivena mala varijabilnost dobivena je samo srednju Bosnu, dok u drugim područjima nije izvršeno slično istraživanje. Može se izvesti zaključak da postoje male razlike između populacija iz različitih ekoloških niša, odnosno 2 151 bp 0,42 0,40 0,48 Aleli sa veličinom bp Allels with size bp 1 2 Heterozigoti Heterozygoty 0,49 0,48 0,50 Heterozigoti Heterozygoty 139 (bp) 151(bp) 0,57 0,43 0,49 0,62 0,38 0,35 0,75 0,25 0,38 0,75 0,25 0,38 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,37 0,63 0,47 0,37 0.63 0,47 da razlike u ekologiji staništa uvjetuju genetičku diferencijaciju među populacijama, a da se te razlike ne mogu dobro registrirati pomoću korištenih genetičkih markera (mikrosatelita). Za razliku od molekularnih analiza, rezultati koje je na morfološkoj razini dobio Ballia n (2000, 2002) pokazuju postojanje razlika unutar i između populacija. Pomoću postupka mikrosatelitske DNK analize možemo vidjeti samo mali dio populacijske genetičke informacije, a velik dio ostaje nedostupan. Ovo nas upućuje daje potrebno usmjeriti istraživanja ka iznalaženju novih početnica. Ostaje ipak i problem da li jedinke divlje trešnje stupaju u križanje s domaćom trešnjom, i na koji način, ili je to pak ta povezanost uvjetovana njihovim ranijim križanjima. Broj biljaka koje predstavljaju populaciju ipak ostaje upitan, jer se pojavljuje problem subjektivnosti pri uzimanju uzorka, odnosno u broju biljaka koje predstavljaju populaciju. Međutim, samo to povećanje broja uzoraka zahtijevalo bi smanjenje broja populacija, jer se uvijek postavljaju limitirajući čimbenici, kao stoje vrijeme potrebno za istraživanje i laboratorijski kapacitet. |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 59 <-- 59 --> PDF |
D. Ballian: VARIJABILNOST M1KROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE ... Šumarski list br. 11-12. CXXVIII (2004). 649-654 ZAKLJUČCI 1. Modifikacijom originalnog recepta za ekstrakciju DNK naspram veličini embriona postignut je dobar rezultat u ekstrakciji, tako da je ova modifikacija uspješna za ekstrakciju DNK iz embrija u sjemenu. 2. U ovom istraživanju samo je jedan par početnica iskazao polimorfizam, i na tom marker lokusu bila su samo dva alela. Kod primjene početnice UDP97402 (F i R) registrirali smo samo dva alela, s veličinom od 139 i 151 parova baza (pb), kao što je dobiveno i u ranijim istraživanjima. 3. Divlja trešnja, kao i sorta domaće trešnje "Alica" nisu pokazale značajnu varijabilnost, što se slaže s rezultatima ranijih istraživanja. 4. Rezultati istraživanja ukazuju da između populacija divlje i pitome trešnje (cv. "Alica") ne postoji velika razlika u strukturi mikrosatelitske DNK. 5. Mala genetička varijabilnost, kako unutarpopulacijska tako i međupopulacijska mogu nam olakšati aktivnosti na poslovima zaštite i očuvanja genofonda divlje trešnje. 6. Buduće aktivnosti na molekularnoj razini treba usmjeriti ka iznalaženju pogodnijih mikrosatelita, za istraživanje genetičke varijabilnosti divlje trešnje, s obzirom da kod morfoloških istraživanja pokazuje veliki unutarpopulacijski varijabilitet. LITERATURA: B a 11 i a n, D. (2000): Početna istraživanja varijabilnosti morfoloških svojstava sjemena divlje trešnje (Prunus avium L.), Šum. list br. 5-6/2000, st. 271-278, Zagreb. Ballian , D. (2002): Variability of characteristics of the wild cherry blossom (Prunus avium L.) in the region of central Bosnia, Annales forestales, 25/2, 1-19, Zagreb. Cipriani, G., G. Lot, W. G. Huang, M. T. Marrazzo, E. Peterlunger, R. Testolin, 1999: AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach (Prunus persica L. Batsch.): isolation, characterisation and cross-species amplification in Prunus. Theoretical and Applied Genetics. 99: 1-2,65-72. Gerlach, H. K., R. Strosser, (1997): Patterns of random amplified polymorphic DNAs for sweet cherry (Prunus avium L.) cultivar identification. Angewandte Botanik 71: 5-6, 212-218. Gerlach, H. K, R. Strosser, (1998): Chain reactions in fruit cultivation: cultivar identification with the aid of DNA fingerprinting. Erwerbsobstbau40: 4, 103-106. Gerlach, H. K., R. Strosser, J. Ystaas, (1998): Sweet cherry cultivar identification using RAPD derived DNA fingerprints. Acta Horticulturae 468, 63-69. Hormaza , J. I. (1999): Early selection in cherry combining RAPDs with embryo culture. Scientia Horticulturae 79: 1-2, 121-126. Iezzoni,A. F., A. M. Hancock, C. R. Hampson, R. L. Anderson, R. L. Perry, A. D. Webster (1996): Chloroplast DNA variation in sour cherry. Acta Horticulturae No. 410, 115-120. Lefort, F., C. G. Douglas, 1999: An efficient micro-method of DNA isolation from mature leaves of four hardwood tree species Acer, Fraxinus, Prunus and Quercus. Ann. For. Sci. 56,259-263. Levi, A., L. J. Rowland, J. S. Hartung, (1993): Production of reliable randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers from DNA of woody plants. Hort. Science, 28: 12, 1188-1190. Malusa,E . (1993): Molecular biology in phylogenetic studies. Evolution and development of cherry species. Rivista di Frutticoltura e di Ortofloricoltura55: 5, 110-112. Malusa, E., A. Marchesini, (1993): A new method to study the genetic variation of vegetals for breeding purposes. Note i: study on Prunus. Fitoterapia 64: 5, 427-432. Malusa, E., S. Sansavini, (1993): Investigation on the interspecific relations of cherry species by means of restriction fragment length polymorphism (RFLP) of chloroplast DNA. Agro Bio Frut, 203-208. Malusa, E., S. Sansavini, (1995): Phylogenetic analysis of Prunus species with RAPDs. Agro Bio Frut - Italia 6 maggio 1994, 145-149. Rogers , S. O. 1997: Molecular biology techniques, EFB 601 laboratory manual. 3rd edition. Saiki, R. K. 1990: Amplification of genomic DNA. In: PCR Protocols: A guide to methods and applications. Ed. Innis, M.A.; Gelfand, D.H.; Sininsky, J.J.; White, T.J. San Diego, Academic Press, 13-20. |
ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 60 <-- 60 --> PDF |
P. Ballian: VARIJABILNOST M1KROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŽNJE ... Šumarski list br. 11-12, CXXVI1I (2004), 649-654 SUMMARY: The variability of the populations of the Prunus avium and their relaitonship with the Prunus avium cv. "Alica " was researched based on the genomic characteristics of the DNA. The material for this research was collected from 69 trees in the Central Bosnia area where 3 populations have been chosen (Mrkovici, Ilijas and Kakanj). For the extraction of the DNA we have used the procedure described by Roger s (1997) but it has been slightly modified based on the size of the embrios. For the PCR analysis the already known microsatellites were used as per Cipriani et al. (1999). For the extraction of DNA from the embryo quite a good result was achieved. In this research, only one pair of the primers has been acceptable which in turn points to the conclusion that in the research of the DNA of the Prunus avium by the microsatellites further developments are needed in the research of the sources of the acceptable primers. In the use of the primer UDP 97-402 (F and R) it has been registered that there were only 2 alells size of which being only 139 and 151 (pb) which was also found in the earlier researches by other authors. The mentioned research of the both Prunus avium and variaety ´Alice" haven´t shown any substantial interpopulation or for population variability which also agrees with the findings of other authors who have done theses researches on the wild cherry. |