DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu




ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 55     <-- 55 -->        PDF

IZVORNI ZNANSTVENI ČLANCI - ORIGINAL SCIENTIFIC PAPERS Šumarski list br. 11-12, CXXVIII (2004), 649-654
UDK 630* 165 (001)


VARIJABILNOST MIKROSATELITNE DNK
U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE
{Prunus avium L.) IZ SREDIŠNJE BOSNE


MICROSATELL1TE DNA VARIABILITY OF
POPULATIONS OF WILD CHERRY
(Prunus Avium L.) FROM CENTRAL BOSNIA


Dalibor BALLIAN´


SAŽETAK: U raduje istraživana mikrosatelitna DNK varijabilnost populacija
divlje trešnje (Prunus avium L.) iz središnje Bosne (Mrkoviči, Ilijaš i
Kakanj), a za kontrolu je iskorištena domaća sorta trešnje (cv. Alica). Za
ekstrakciju DNK korištena je modificirana Roger s-ova (1997) procedura
za ekstrakciju genomske DNK iz embriona. Genetička varijabilnost populacija
procijenjena je uz pomoć visoko ponavljajućih DNK molekula (simple
sequence repeats - SSR). Potvrđeni su rezultati ranijih istraživanja u kojima
je registrirana relativno mala genetička varijabilnost trešnje (Prunus avium
L.), uz korištenje određene grupe mikrosatelita.


Ključne riječi: Prunus avium L., DNK, ekstrakcija, mikrosateliti.


UVOD


U suvremenim istraživanjima polimorfizma, kod eha i Strossera (1997, 1998), Gerlacha i sur.
vrsta šumskog drveća, sve značajnije mjesto zauzima (1998). Medu tim radovima interesantan je rad koji se
analiza varijabilnosti molekule DNK. Ova suvremena bavi mogućnostima rane selekcije kultivara trešnje, od
metoda analize doprinosi novim spoznajama u sisteHormaz
a (1999). Značajni su i drugi radovi koji se
matici biljaka. Dolazi se do novih spoznaja, na temelju odnose na pitanja osnovnih fundamentalnih istraživakojih
se pretpostavlja da će stara shvaćanja o vrstama nja kod raznih vrsta drveća, a između ostalog i roda
biti revidirana i da će mnoge opisane vrste dobiti status Prunus, a odnose se djelomično na divlju i domaću
podvrsta, varijeteta ili ekotipova. trešnju (Iezzoni i sur. 1996, Levi i sur. 1993, Ma


lusa 1993, Malusa iMarchesini 1993, Malu-


Molekularne metode do sada su našle daleko veću


sa iSansavini 1993 i 1995).


primjenu u poljoprivredi nego u šumarstvu. Ipak ima
mnogo istraživanja na šumskim vrstama drveća, poseCilj
rada bio je procijeniti stupanj unutarpopulacijbice
hrastovima, jasenima, bukvi, crnom boru, itd. Na ske i međupopulacijske varijabilnosti divlje trešnje u
razini Europe pokrenut je čitav niz značajnih projekata središnjoj Bosni, te ove rezultate usporediti s rezultatiu
cilju izučavanja DNK, kartiranja gena kod ekonomma
koji su do sada publicirani. Djelomična usporedba
ski značajnih vrsta drveća. može se izvršiti s radom C i p r i a n i j a i sur. (1999).


Do sada provedena istraživanja na DNK divlje trešDobiveni
rezultati omogućili bi da se uoče razlike
nje (Prunus avium L.) objavljena su u više radova o između populacija, te da se utvrdi da li se divlja trešnja
ekstrakciji DNK (Saiki 1990, Lefort i Douglas značajno razlikuje na molekularnom razini od domaće
1999). Ostala istraživanja koja su tretirala DNK trešsorte
trešnje koja je najzatupljenija u području istražinje,
odnose se na domaće sorte trešanja značajne u vovanih
populacija. Rezultati bi nas usmjerili na pravi
ćarskoj proizvodnji, te su najznačajniji radovi Gerla -put iznalaženja optimalne metode za determinaciju


čiste divlje trešnje, te olakšalo poslove na očuvanju ge


netičke raznolikosti ove vrste.


Dr. se. Dalibor Ballian, Šumarski fakultet u Sarajevu




ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 56     <-- 56 -->        PDF

D. Ballian: VARIJABILNOST MIKROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE , Šumarski list br. 11-12, CXXVII1 (2004), 649-654
MATERIJAL I METODA RADA


Tijekom 1999. godine sakupljeno je sjeme divlje
trešnje iz tri populacije na području središnje Bosne.
Populacije se nalaze u različitim ekološkim nišama, a
udaljene su jedna od druge 30 km. Sjeme je sakupljeno
sa 69 stabala (populacija Mrkoviči 31 stablo, Ilijaš 15,
Kakanj 23), a za kontrolu je korišteno sjeme ubrano s
jednog stabla domaće trešnje, poznate autohtone sorte
"Alica". Inače, ova je sorta najviše zastupljena u voćnjacima
gornjeg i srednjeg toka rijeke Bosne, gdje je i
sabiran materijal za istraživanje. Fenologija cvjetanja
kultivara poklapa se sa cvjetanjem divlje trešnje, kao i
vrijeme sazrijevanja plodova. Za ekstrakciju DNK korišten
je embrij koji je izvađena iz sjemena mehaničkim
putem. Njegova veličina i masa zavisila je od veličine
sjemena, a masa se kretala oko 0,0005 g kod divlje
trešnje, do 0,0008 g kod domaće trešnje.


Za proučavanje unutarpopulacijske varijabilnosti
slučajnim izborom uzeta su tri stabla iz populacije Mr


Izolacija genomske DNK


Izolacija je izvršena za genomsku (cjelokupnu staničnu)
DNK (Rogers 1997). Mala veličina embriona
otežavala je ekstrakciju, ali je metoda uspješno prilagođena
količini embriona u prvim etapama izolacije na
način kako slijedi.


Embrioni su držani u tubama na temperaturi od
-70 °C, najmanje 24 sata. Po njihovom vađenju iz frižidera,
odmah je vršena maceracija specijalno konstru


PCR-procedura i elektroforetska analiza


Korištene su početnice sa 18-22 baze, proizvođača
"Genosys biotechnologies - Cambridge (UK)" (Tab.
1.). Unatoč različitim temperaturama nalijeganja (TA)


koviči, sa po osam sjemenki (ukupno 24 ekstrakcije),
dva stabla iz populacije Ilijaš (16 ekstrakcija) i dva stabla
iz populacije Kakanj (16 ekstrakcija). Također je
rađena ekstrakcija i za domaću trešnju sorte "Alica"
koja je služila kao kontrola, jer je najčešća u području
istraživanih populacija (osam ekstrakcija). Za istraživanje
međupopulacijske varijabilnosti slučajnim je izborom
uzet po jedan embrion od svakog stabla, na
kojem je izvršena ekstrakcija (70 ekstrakcija). Po završenoj
ekstrakciji za preparate je primijenjena standardna
je PCR procedura, a potom analiza na gelu.


Varijabilnost između stabala i populacija procijenjena
je uz primjenu X2-testa, testiranjem dobivenih
distribucija u populacijama. Primjenom Hardy-Wainbergovog
zakona izračunat je broj heterozigota u populacijama
za sve tri populacije.


iranom alatkom, uz dodavanje 2 x CTAB buffera (2 %
CTAB, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl) u
prilagođenoj količini od 50 ul, što se pokazalo sasvim
dovoljnim za veličinu embriona. Sva daljnja procedura
odvijala se uz manje preinake Rogersovo g (1997)
protokola, prema količini materijala koji je služio za
ekstrakciju. Modifikacija je rezultirala dovoljnom količinom
DNK na kraju procesa izolacije genomske DNK.


u istraživanju je za sve početnice uspješno korištena


TA = 58°C.


Tablica 1. Osnovni podaci o parovima početnica (Genosys biotechnologies - Cambridge).


Table 1


Redni broj


No.


1
2
3
4


Basic details of the primers (Genosys biotechnologies -Cambridge).


Početnice


Primers


UDP96-003F
UDP96-003R
UDP96-018F
UDP96-018R
UDP97-402F
UDP97-402R
UDP98-407F
UDP98-407R


Broj baza Sekvenca (5´-3´)
No. of bases Sequence (5´-3´)
20 TTGCTCAAAAGTGTCGTTGC
20 ACACGTAGTGCAACACTGGC
20 TTCTAATCTGGGCTATGGCG
22 GAAGTTCACATTTACGACAGGG
22 TCCCATAACCAAAAAAAACACC
20 TGGAGAAGGGTGGGTACTTG
20 AGCGGCAGGCTAAATATCAA
19 AATCGCCGATCAAAGCAAC
TA*=4(#GiC) + 2(#AiT)


Temperatura
topljenja


Melting
temperature (Tm)
63,9
63,9
63,8
62,2
63,3
63,8
63,4
65,0


Temperatura
nalijeganja


Annealing
temperature (TA)*
58
62
60
64
60
62
58
56


(#G i C) -ukupan broj baza G i C koje se nalaze u početnici
(#A i T) -ukupan broj baza A i T koje se nalaze u početnici




ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 57     <-- 57 -->        PDF

D. Ballian: VARIJABILNOST MIKROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE .. Šumarski list br. 11-12, CXXVIII (2004), 649-654
Za PCR djelovanje učinjen je
reakcijski volumen od 20ul za par
Tablica 2. PCR procedura
Table 2 PCR procedure
početnica i prikazan u tablici 3, a
procedura je trajala kao što je priVrsta
temperature
Type of the temperature
Temperatura
Temperature
Vrijeme
Time
Broj krugova
No. of circles
kazano u tablici 2. početna temperatura 94 °C 2 min
Nakon zavšene PCR procedure,
razdvajanje PCR produkta izvršeno
je elektroforezom na 1,5 %
agarnom gelu (Ultra pure DNA
grade agarose - Bio Rad). Kako se
temperatura denaturacije
temperatura hibridizacije
temperatura elongacija
završna temperatura
temperatura čekanja
94 °C
55 °C
72 °C
72°C
4°C
1 min
1 min
1 min
8 min
-
35
35
35
radi o specifičnim početnicama,


nije bilo potrebe da se radi na poliakridamidnom gelu, Nakon elektroforeze bojenje gela izvršeno je ethi


nego su vrpce izbrajane na agarnom gelu. Vrijeme podium
bromideu koncentracije od 1 ug/ml, u trajanju od
trebno za rad elektroforeze bilo je u zavisnosti od veli20
minuta. Potom je izvršeno snimanje gela i izbrajane
čine gela, i kretalo se oko jednog sata pri istosmjernoj vrpci.
struji od 50 ili 100V.


Tablica 3. PCR standardni protokol


Table 3 PCR standard protocol


Protokol za broj uzoraka 1 7 11 15 19 21
Broj analiza 1 6 10 13 18 20
u ul U jLll u ul u ul U jLll U jLll
H20 9,92 69,44 109,12 148,80 188,48 208,32
10 x Buffer 2,00 14,00 22,00 30,00 38,00 42,00
lOxdNTP´s 2,00 14,00 22,00 30,00 38,00 42,00
Početnica 1 1,00 7,00 11,00 15,00 19,00 21,00
Početnica 2 1,00 7,00 11,00 15,00 19,00 21,00
Taq 0,08 0,56 0,88 1,20 1,52 1,68
Otopina DNA 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
Ukupno 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00


REZULTATI ISTRAŽIVANJA I RASPRAVA


Istraživanja su pokazala da od četiri para početnica monomorfizam, iako je registrirana u ranijim istraživakoji
su korišteni u ovim istraživanjima samo jedan par njima, ali na drugim vrstama iz roda Prunus (P persica
pokazuje polimorfizam (Tab. 4.). U drugih parova poL.)(
Ciprian i i sur. 1999).
četnica nije registrirana varijabilnost, jer su pokazali


Tablica 4. Frekvencije alela i heterozigotnost.kod svih uzoraka.


Table 4 Frequency of the alels and heterozygosity in all samples


Početnice
Primers 1
Aleli (bp)
Alleles (bp)
2
Heterozigoti
Heterozygoty
Vrpce
Band
Broj analiza
No. ofanalisys
UDP96-003 bp.149
1.00
0
0 Nema polimorfizma Jednostruka 70
UDP96-018 bp.240
1,00
0
0 Nema polimorfizma Jednostruka 70
UDP97-402 bp.139
0,57
bp.151
0,43 0,49 Dvostruka 126
UDP98-407 bp.136
1,00
0
0 Nema polimorfizma Jednostruk 70


bp. - parova baza


Iz tih je razloga u ovom istraživanju varijabilnosti dobila očekivana heterozigotnost. Prosječna heterozi-
DNK korištena početnica UDP 97-402, kod koje se gotnost za sve populacije iznosi 0,49 (Tab. 4.). Najveću
651




ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 58     <-- 58 -->        PDF

D. Ballian: VARIJABILNOST MIKROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE ... Šumarski list br. 11-12, CXXVIII (2004), 649-654
unutarpopulacijsku heterozigotnost imala je populacija ma, što se može vidjeti iz tablice 6. Najveću heteroziKakanj
(0,50), dok najmanju pokazuje populacija Ilijaš gotnost pokazalo je stablo broj 45 i 58 iz populacija
(0,48) (Tab. 5,). Ilijaš i Kakanj (0,50). Najmanju heterozigotnost ima


stablo broj 18 iz populacije Mrkoviči.


Kao što je uočena varijabilnost između populacija,


tako je zabilježena i varijabilnost u samim populacijaTablica
5. Dobivene frekvencije alela i njihova heterozigotnost u.populacijama.


Table 5 The frequencies of the alleles and heterozygosity in the populations


Aleli sa veličinom bp
Populacija Broj stabala za analizu Allels with size bp


Population No. of trees for the analisys 1
139bp
Mrkoviči 31 0,58
Ilijaš 15 0,60
Kakanj 23 0,52


Tablica 6. Frekvencije i heterozigotnost stabala u populacijama.


Table 6 Frequencies of the alels and heterozigotry in the trees.alleles


Populacija


Population


Mrkoviči
Ilijaš
Kakanj
Domaća trešnja


Broj i šifra stabla Broj analiziranih embriona


No. trees No. of trees for the embrion


Stablo 1. (8) 8
Stablo 2. (18) 8
Stablo 3. (28) 8
Stablo 1. (38) 8
Stablo 2. (45) 8
Stablo 1. (58) 8
Stablo 2. (68) 8
Stablo 1. (70) 8


Ekološka valencija vrste nasljedna je karakteristika,
odnosno njezina je sposobnost prilagodbe određena
nasljednom osnovom ili genomom biljke.


Pomoću prikazanih genetičkih parametara, razlike
između populacija ili unutar populacija obično bivaju
vidljive i jasne, ali u ovom slučaju su male. Mogući su
uzroci tih malih različitosti, osim prirodne selekcije i
antropogena djelovanja te razvojni čimbenici ili procesi
prilagođavanja na određene ekološke uvjete.


To proizlazi iz činjenice da je područje središnjih
Dinarida vrlo specifično kada su posrijedi uvjeti okoliša,
jer na vrlo malom prostoru postoji velika varijabilnost
klimatskih, edafskih, orografskih i drugih čimbenika
koji izravno utječu na diferencijaciju različitih
ekotipova. Iako stručnjaci smatraju da vrste šumskog
drveća s područja Dinarida pokazuju veliku varijabilnost,
u usporedbi s istim vrstama sa sjevera, u slučaju
divlje trešnje nismo mogli to zaključiti.


Dobivena mala varijabilnost dobivena je samo
srednju Bosnu, dok u drugim područjima nije izvršeno
slično istraživanje.


Može se izvesti zaključak da postoje male razlike
između populacija iz različitih ekoloških niša, odnosno


2
151 bp
0,42
0,40
0,48


Aleli sa veličinom bp


Allels with size bp


1 2


Heterozigoti


Heterozygoty


0,49
0,48
0,50


Heterozigoti


Heterozygoty


139 (bp) 151(bp)
0,57 0,43 0,49
0,62 0,38 0,35
0,75 0,25 0,38
0,75 0,25 0,38
0,50 0,50 0,50
0,50 0,50 0,50
0,37 0,63 0,47
0,37 0.63 0,47


da razlike u ekologiji staništa uvjetuju genetičku diferencijaciju
među populacijama, a da se te razlike ne
mogu dobro registrirati pomoću korištenih genetičkih
markera (mikrosatelita). Za razliku od molekularnih
analiza, rezultati koje je na morfološkoj razini dobio
Ballia n (2000, 2002) pokazuju postojanje razlika
unutar i između populacija.


Pomoću postupka mikrosatelitske DNK analize
možemo vidjeti samo mali dio populacijske genetičke
informacije, a velik dio ostaje nedostupan. Ovo nas
upućuje daje potrebno usmjeriti istraživanja ka iznalaženju
novih početnica.


Ostaje ipak i problem da li jedinke divlje trešnje
stupaju u križanje s domaćom trešnjom, i na koji način,
ili je to pak ta povezanost uvjetovana njihovim ranijim
križanjima.


Broj biljaka koje predstavljaju populaciju ipak ostaje
upitan, jer se pojavljuje problem subjektivnosti pri uzimanju
uzorka, odnosno u broju biljaka koje predstavljaju
populaciju. Međutim, samo to povećanje broja
uzoraka zahtijevalo bi smanjenje broja populacija, jer se
uvijek postavljaju limitirajući čimbenici, kao stoje vrijeme
potrebno za istraživanje i laboratorijski kapacitet.




ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 59     <-- 59 -->        PDF

D. Ballian: VARIJABILNOST M1KROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŠNJE ... Šumarski list br. 11-12. CXXVIII (2004). 649-654
ZAKLJUČCI


1.
Modifikacijom originalnog recepta za ekstrakciju
DNK naspram veličini embriona postignut je dobar
rezultat u ekstrakciji, tako da je ova modifikacija
uspješna za ekstrakciju DNK iz embrija u sjemenu.
2.
U ovom istraživanju samo je jedan par početnica iskazao
polimorfizam, i na tom marker lokusu bila su
samo dva alela. Kod primjene početnice UDP97402
(F i R) registrirali smo samo dva alela, s veličinom
od 139 i 151 parova baza (pb), kao što je dobiveno
i u ranijim istraživanjima.
3.
Divlja trešnja, kao i sorta domaće trešnje "Alica"
nisu pokazale značajnu varijabilnost, što se slaže s
rezultatima ranijih istraživanja.
4.
Rezultati istraživanja ukazuju da između populacija
divlje i pitome trešnje (cv. "Alica") ne postoji velika
razlika u strukturi mikrosatelitske DNK.
5.
Mala genetička varijabilnost, kako unutarpopulacijska
tako i međupopulacijska mogu nam olakšati aktivnosti
na poslovima zaštite i očuvanja genofonda
divlje trešnje.
6.
Buduće aktivnosti na molekularnoj razini treba
usmjeriti ka iznalaženju pogodnijih mikrosatelita,
za istraživanje genetičke varijabilnosti divlje trešnje,
s obzirom da kod morfoloških istraživanja pokazuje
veliki unutarpopulacijski varijabilitet.
LITERATURA:


B a 11 i a n, D. (2000): Početna istraživanja varijabilnosti
morfoloških svojstava sjemena divlje trešnje
(Prunus avium L.), Šum. list br. 5-6/2000, st.
271-278, Zagreb.


Ballian , D. (2002): Variability of characteristics of
the wild cherry blossom (Prunus avium L.) in
the region of central Bosnia, Annales forestales,
25/2, 1-19, Zagreb.


Cipriani, G., G. Lot, W. G. Huang, M. T. Marrazzo,
E. Peterlunger, R. Testolin,
1999: AC/GT and AG/CT microsatellite repeats
in peach (Prunus persica L. Batsch.): isolation,
characterisation and cross-species amplification
in Prunus. Theoretical and Applied Genetics.


99: 1-2,65-72.
Gerlach, H. K., R. Strosser, (1997): Patterns of
random amplified polymorphic DNAs for sweet
cherry (Prunus avium L.) cultivar identification.
Angewandte Botanik 71: 5-6, 212-218.
Gerlach, H. K, R. Strosser, (1998): Chain reactions
in fruit cultivation: cultivar identification
with the aid of DNA fingerprinting. Erwerbsobstbau40:
4, 103-106.
Gerlach, H. K., R. Strosser, J. Ystaas, (1998):
Sweet cherry cultivar identification using RAPD
derived DNA fingerprints. Acta Horticulturae
468, 63-69.
Hormaza , J. I. (1999): Early selection in cherry
combining RAPDs with embryo culture. Scientia
Horticulturae 79: 1-2, 121-126.
Iezzoni,A. F., A. M. Hancock, C. R. Hampson,


R. L. Anderson, R. L. Perry, A. D. Webster
(1996): Chloroplast DNA variation in sour
cherry. Acta Horticulturae No. 410, 115-120.
Lefort,
F., C. G. Douglas, 1999: An efficient
micro-method of DNA isolation from mature


leaves of four hardwood tree species Acer,
Fraxinus, Prunus and Quercus. Ann. For. Sci.
56,259-263.


Levi, A., L. J. Rowland, J. S. Hartung, (1993):
Production of reliable randomly amplified polymorphic
DNA (RAPD) markers from DNA of
woody plants. Hort. Science, 28: 12, 1188-1190.


Malusa,E . (1993): Molecular biology in phylogenetic
studies. Evolution and development of cherry
species. Rivista di Frutticoltura e di Ortofloricoltura55:
5, 110-112.


Malusa, E., A. Marchesini, (1993): A new
method to study the genetic variation of vegetals
for breeding purposes. Note i: study on Prunus.
Fitoterapia 64: 5, 427-432.


Malusa, E., S. Sansavini, (1993): Investigation
on the interspecific relations of cherry species
by means of restriction fragment length polymorphism
(RFLP) of chloroplast DNA. Agro
Bio Frut, 203-208.


Malusa, E., S. Sansavini, (1995): Phylogenetic
analysis of Prunus species with RAPDs. Agro
Bio Frut - Italia 6 maggio 1994, 145-149.


Rogers , S. O. 1997: Molecular biology techniques,
EFB 601 laboratory manual. 3rd edition.


Saiki, R. K. 1990: Amplification of genomic DNA.
In: PCR Protocols: A guide to methods and
applications. Ed. Innis, M.A.; Gelfand, D.H.;
Sininsky, J.J.; White, T.J. San Diego, Academic
Press, 13-20.




ŠUMARSKI LIST 11-12/2004 str. 60     <-- 60 -->        PDF

P. Ballian: VARIJABILNOST M1KROSATELITNE DNK U POPULACIJAMA DIVLJE TREŽNJE ... Šumarski list br. 11-12, CXXVI1I (2004), 649-654
SUMMARY: The variability of the populations of the Prunus avium and
their relaitonship with the Prunus avium cv. "Alica " was researched based on
the genomic characteristics of the DNA. The material for this research was
collected from 69 trees in the Central Bosnia area where 3 populations have
been chosen (Mrkovici, Ilijas and Kakanj). For the extraction of the DNA we
have used the procedure described by Roger s (1997) but it has been slightly
modified based on the size of the embrios. For the PCR analysis the already
known microsatellites were used as per Cipriani et al. (1999). For the
extraction of DNA from the embryo quite a good result was achieved.


In this research, only one pair of the primers has been acceptable which in
turn points to the conclusion that in the research of the DNA of the Prunus
avium by the microsatellites further developments are needed in the research
of the sources of the acceptable primers.


In the use of the primer UDP 97-402 (F and R) it has been registered that
there were only 2 alells size of which being only 139 and 151 (pb) which was
also found in the earlier researches by other authors.


The mentioned research of the both Prunus avium and variaety ´Alice"
haven´t shown any substantial interpopulation or for population variability
which also agrees with the findings of other authors who have done theses
researches on the wild cherry.