DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 36     <-- 36 -->        PDF

538




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 33     <-- 33 -->        PDF

M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
Slika 7. Prikaz slijeda nukleotida 4. introna 5. podjedinice NAD dehidrogenaze (nad5-4) obične jele (Abies alba Mill.) i kavkaske jele
(Abies nordmanniana Spach.). Sekvencirani fragment prikazan je velikim tiskanim slovima. Početnice su označene svijetlo
smeđom bojom i masno otisnute. Sekvence koje predstavljaju insercije u odnosu na haplotip 2 označene su crvenom, odnosno
plavom bojom. Sekvenca tagatatat kojom počinje insercija označena je zelenim kvadratom.
hap 1 = haplotip 1 obične jele; dulji fragment 275 pb
hap 2 = haplotip 2 obične jele; kraći fragment 180 pb
hap 3 = haplotip 3 kavkaske jele; dobiveni fragment od približno 450 pb
nord = haplotip kavkaske jele (prepisano iz baze “Entrez») naveden zbog usporedbe


Figure 7 Nucleotid sequence of 4. intron 5. subunit of NAD dehydrogenase (nad5-4) gene of silver fir (Abies alba Mill.) and Nordmann fir
(Abies nordmanniana Spach.). Sequenced phragment is represented by bold capital letters. Primers are bold, light brown.
Inserted sequences (insertions) relative to haplotype 2 are marked red and blue respectively (koja kako?). Sequence tagatatat is
the beginning of insertion and is demonstrated by green square.


hap 1 = haplotype 1 of silver fir; larger fragment 275 bp
hap 2 = haplotype 2 of silver fir; shorter fragment 180 bp
hap 3 = haplotype 3 kavkaske fir; fragment of aproxymately (ili app.) 450 bp
nord = haplotype of kavkaske fir (from “Entrez” base) for comparison


Pojava spontane hibridizacije A nordmanniana x A alba
Apereance of spontaneous hibridisation ofA. nordmanniana × A. alba


Kod provenijencija Macelj i Trakošćan u određenim mtDNA kavkaske jele, koje joj i fenotipski više odgova


uzorcima dobiven je prosječan broj parova baza ampli-raju. U populaciji Trakošćan omjer je bio 1 : 4 (Slika 8.).


ficiranog fragmenta od približno 450 pb. Za sve prvotno Uzorci s Trakošćana i novi uzorci populacije Macelj u


analizirane uzorke iz populacije Macelj utvrđene su potpunosti fenotipski odgovaraju običnoj jeli. Od tri




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 32     <-- 32 -->        PDF

M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
Određivanje veličine fragmenata – Detection of fragment sizes


Produkti dobiveni lančanom reakcijom polimeraze
analizirani su uređajem 2100 Bioanalyzer tvrtke Agilent
Technologies (Slika 6.).


Slika 6. 2100 Bioanalyzer tvrtke Agilent Technologies
Figure 6 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies


Analiza se odvijala na “chipu” (DNA 1000 lab-chip
kit) na koji se stavi gel, boja koja se veže na DNAi 1 µl
uzorka umnožene DNA. U jednu od jažica stavi se lje


stvica (ladder) koja sadrži fragmente DNA poznatih
veličina od 25 pb* do 1,5 kb**. U sve ostale jažice
stavlja se unutrašnji biljeg od 25 pb i 1,5 kb. Uređaj sadržava
detektor koji registrira vrijeme izlaska molekule
DNA. Na osnovi veličine fragmenata u jažici s ljestvicom
i vremena njihova izlaska, uređaj računa veličinu
molekula DNA u uzorcima. Biljeg u uzorcima pomaže
njihovu pravilnom smještanju u raspon od 25 do
1500 pb. Uređaj bilježi veličinu svakog od fragmenata
u parovima baza te može simulirati i izgled gela.


Lančanom reakcijom polimeraze (PCR) umnožen je
po jedan fragment DNA u svakom uzorku. Na osnovi
veličine umnoženog fragmenta određen je haplotip jedinke
u skladu s prethodnim istraživanjem (Lie pe l t i
sur. 2002, Gömöry i sur. 2004). Veći fragment označen
je brojem 1, a manji brojem 2. Kod određenog broja
uzoraka utvrđen je novi fragment od približno 450 pb,
kojem je naknadno određen slijed nukleotida označen je
brojem 3.


Fragment 3 sekvenciran je u laboratoriju VBCGENOMICS
GmbH u Beču. Pretragom javne baze
podataka Entrez Nucleotide na internet stranicama
NCBI-a (National Center for Biotechnology Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) određena
je vrsta kojoj pripada navedeni fragment.


REZULTATI I RASPRAVA


Od dvadeset sedam obrađenih provenijencija obične
jele iz Hrvatske i Slovenije, deset ih sadržava samo
dulji fragment (Rudač, Bistranska gora, Djedovica-
Trešnjevica, Mašun, Podturen, Gospić, Donji Lapac,
Korenica, NP Plitvička jezera i Gračac-Velebit). Dulji
fragment odnosno alel 1, karakterističan je za središnju
i zapadnu Europu. Samo kraći fragment (alel 2) karakterističan
za jugoistočnu Europu nalazimo u devet populacija
(Gluhe Drage, Belevine, Nadžak bilo, Biokovo,
Brloško, Rudač 2a, Alilovica, Rastovka i Duliba).
Šest provenijencija: Zapadni Papuk, Rudnik, Josipovac,
Potočine Crna kosa, Miletka i Gračac-Lička Plješivica
sadržavaju oba haplotipa. U njima u različitim
omjerima nalazimo oba alela.


Odstupanje je dobiveno za šest uzoraka iz populacije
Macelj i za jedan uzorak iz populacije Trakošćan.
Prosječan broj parova baza dobivenog fragmenta iznosio
je približno 450 pb. Utvrđivanjem slijeda nukleotida
toga fragmenta i usporedbom s podacima iz baze
podataka (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) ustanovljeno
je da 450 pb dugi fragment odgovara fragmentu
Nad5-4 kavkaske jele.


* pb = par baza;
** kb = kilo baza = 1000 pb
Results and discussion


Na Slici 6. dan je prikaz slijeda nukleotida četvrtog
introna pete podjedinice NAD dehidrogenaze
(nad 5-4). Razlika u duljini fragmenata haplotipa 2 i
haplotipa 1 je 80 pb (Slika 7.). Na prikazu slijeda nukleotida
insercija je označena crvenom bojom. A.
nordmanniana ima dodatnu sekvencu, na prikazu
označenu plavom bojom, ubačenu (insertiranu) neposredno
iza insercije haplotipa 1. Obje insercije započinju
sekvencom tagatatat.




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 31     <-- 31 -->        PDF

M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
Tablica 3. Priprema 2x pufera
Table 3 Preparation of 2x buffer


tvar konc. matične otopine volumen
substance conc. of stock solution volume
PCR pufer
MgClj
mješavina dNTP
BSA
dH20
ukupni volumen
total volume
lOx
25 mM
10 mM za svaki dNTP
10,08 mg/ml
-
200 (iL
144 (iL
20 (iL
39,68 (iL
596,32 (iL
1000 , L


2x pufer pripremljen je razrjeđenjem 10x pufera uz
dodatak magnezijev-klorida i goveđeg serumskog
albumina (BSA). Postupak pripreme iz matičnih otopina
opisan je u Tablici 4. (10x pufer i MgCl2 dobiju se u
kompletu s polimerazom).


Lančana reakcija polimerazom (PCR) provedena je
uređajem PTC-100 (Programmable Thermal Controller)
tvrtke MJ Research, Inc. (Slika 4.).


Tablica 4. Sastav otopine za odvijanje lančane reakcije poli


merazom za jedan uzorak
Table 4 Composition of PCR solution, for one sample


Tvar
Količina


substance
volume


2x pufer 12,5 (iL
početnica 1 2,4 (iL
početnica 2 2,4 (iL
Taq DNApolimeraza, 5U/(il 0,05 (iL
dHjO 2,65 (iL
otopina DNA 5(iL
ukupni volumen


25 (iL


total volume


Programiranje uređaja za PCR obavljeno je prema
L i e p e l t u i sur. (2002).


Prvi je korak denaturacija u trajanju od 3 minute na
94 °C da bi se razdvojili lanci DNA. Nakon toga slijedilo
je 30 ciklusa umnožavanja koji su se sastojali od
tri koraka:


razdvajanje dvostruke uzvojnice DNA (1 min na
92 °C, eng. denaturation)


vezanje početnica na razdvojene DNA lance (1 min
na 52,5 °C, eng. annealing)


sinteza novog lanca DNA (1 min 20 s na 72 °C, eng.
elongation).


Nakon 30 ciklusa slijedi zadnji tzv. elongacijski korak
od 8 min na 72 °C, kako bi se do kraja sintetizirali fragmenti
koji to nisu stigli za vrijeme prethodnih ciklusa.


Slika 4. Uređaj za provođenje PCR-a
Figure 4 PCR machine


Kvalitetu umnožavanja provjerili smo na 1 %-tnom
gelu agaroze (Slika 5.). Produkti amplifikacije čuvani
su na 4 °C do analize.


Lančanom reakcijom polimerazom umnožen je
fragment mitohondrijskoga gena za četvrti intron pete
podjedinice NAD dehidrogenaze (nad5-4).


Slika 5. Provjera PCR-a na gelu agaroze
Figure 5 Checking of PCR fragment(s) on agarose gel




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 30     <-- 30 -->        PDF

M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
Tablica 2. Sastav ekstrakcijskog pufera
Table 2 Composition of extraction buffer


o posi
Tvar
substance


ATMAB
NaCl 5 M
EDTA0,5 M, pH-8,0
Tris HCl 1 M, pH-8,0
PVP


dH O


Ditiotreitol*


r


Količina


quantity


20 g
280 mL
40 mL
100 mL


lO


do 1 L
0,3 g na 40 mL pufera


* Ditiotreitol je dodan nakon autoklaviranja, jer se autoklaviranjem
raspada. – Dithiotreitol is added after autoclaving,
because it is otherwise degraded.
Centrifugiranjem na 13000 okretaja u trajanju od 10 minuta
odvojile su se tri faze: gornja vodena, srednja s čvr-


Slika 2. Odvojene tri faze nakon centrifugiranja na 13000 okretaja
u minuti
Figure 2 3 separated phases after centrifugation on 1300 rpm


Slika 3. Istaložene molekule nukleinskih kiselina
Figure 3 Pelet of nucleic acids


stim ostacima stanica i tkiva, te donja faza u kojoj je
diklormetan (Slika 2.). Gornja, vodena faza otpipetirana
je u čistu epruvetu. Zbog ostataka smole u vodenoj
fazi postupak odjeljivanja diklormetanom proveden
je dva puta. Vodenoj fazi je dodano 2/3 volumena
(400–450 µl) hladnog izopropanola (–20 °C).


Otopina je inkubirana 60 min na –20 °C, nakon
čega su se centrifugiranjem na 13000 okretaja po
minuti u trajanju od 10 min istaložile molekule
nukleinskih kiselina (Slika 3.). Tekuća je faza izdvojena
iz epruvete, a talog nukleinskih kiselina ispran s 1
ml 76 %-tnog etanola.


Nakon 45 minuta sušenja dodano je 105 µl sterilizirane
deionizirane vode. Tako dobivena matična otopina
nukleinskih kiselina (stock solution) čuvana je na
–20 °C. Prisutnost RNA molekula zajedno s DNA molekulama
nije smetala pri daljnjoj analizi.


Lančana reakcija polimerazom (PCR) - Polymerase chain reaction (PCR)


Lančana reakcija polimerazom (PCR) jedna je od
tehnika molekularne biologije koja se koristi za umnožavanje
određenog dijela DNA. Sam postupak odvija
se u posebno izrađenim uređajima, koji reakcijsku otopinu
zagrijavaju i hlade na određene temperature u
određeno vrijeme i u točno određenim ciklusima. Postupak
ne bi bio moguć bez termostabilnih polimeraza
koje se izoliraju iz termofilnih mikroorganizama. Najčešće
korištena termostabilna polimeraza je Taq (polimeraza
izolirana iz bakterije Thermus aquaticus). Radi
se o termofilnoj bakteriji prvotno pronađenoj u Yellowstone-
u, čiji je životni optimum na 70 C (50 C – 80 C)


oo o


(www.bact.wisc.edu/Bact303/b27).


Postupak odvijanja PCR-a je sljedeći:


U 95 µl sterilne destilirane vode dodano je pet µl
matične otopine nukleinskih kiselina (5 % razrjeđenje).
Otopina za umnožavanje DNA fragmenata sadržavala
je:


> početnice za nad5-4 fragment
.Ta q DNApolimerazu


Čdeioniziranu vodu i
Č razrijeđenu otopinu nukleinskih kiselina
2x pufer pripremljen je unaprijed, a njegov sastav na


veden je u Tablici 3.


Slijed nukleotida početnica je:
5’-GGACAATGACGATCCGAGATA-3’, odnosno
5’ -CATCCCTCCCATTGCATTAT-3’.


Njima je umnožen fragment DNA gena nad5-4.
Smjesa za amplifikaciju pripremljena je za ukupni broj
uzoraka s kojim se radilo, s time da je ukupni volumen
po uzorku bio 25 µL (Tablica 4.).




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 29     <-- 29 -->        PDF

M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
Osnovni podaci o istraživanim provenijencijama ković 2003) koji su poslužili za uzorkovanje kao i pro(
Uprava šuma, Šumarija) odakle je skupljano sjeme za venijenicjcje
ee ko analizirane, a nema ih u pokusima,


kojje
ee s
ssu
uu anal


osnivanje pokusa provenijencija (Gračan 2001, Ivan-prikazanii s
ssu
uu u
uu tablici 1.
Tablica 1. Osnovni podaci o istraživanim provenijencijama obične jele


Table 1 Silver fir provenance datas


Prov.


prov


P-1
P-2
P-3
P-4
P-5
P-6


P-7


P-8
P-9
P-10
P-11
P-12
P-13
P-14


Šumarija
Forest office


Našice, Voćin
Požega, Kamensko


Koprivnica, Ivanec
Zagreb, Krapina
Zagreb, Zagreb
Ogulin, Josipdol


Ogulin, Ogulin


Delnice, Gomirje
Delnice, Vrbovsko
Delnice, Vrbovsko
Delnice, Skrad
Delnice, Skrad
Delnice, Zalesina
Delnice, Tršće


Gosp. jedinica
Management unit


Djedovica -Trešnjevica 12c


Zapadni Papuk II 32d


Trakošćan 7d
Macelj


Bistranska gora 17b


Alilovica 13b


Josipovac 38b


Potočine-Crna kosa 8b
Gluhe Drage 8


Miletka 17b
Rudač 2a
Rudač la
Belevine


Rudnik 13a


Prov.


prov


P-15
P-16
P-17
P-18
P-19
P-20


P-21
P-22
P-23
P-24
P-25
P-26
P-27


Za analizu mtDNA u ovom radu korištena je tehnika
raznolikosti duljine umnoženih fragmenata. Cjelokupnu
analizu mtDNA možemo podijeliti u tri glavna dijela:
sakupljanje uzoraka, izolacija cjelokupne DNA i lančana
reakcija polimerazom (PCR). Nakon uspješno prove


Šumarija
Forest office
Senj, Novi Vinodolski
Senj, Krasno
Gospić, Otočac
Split, Imotski


Postojna


Novo Mesto


Gosp. jedinica
Management unit


Duliba 1


Nadžak bilo 15, 16


Rastovka 11
Biokovo 1
Mašun
Crmošnjica, Podturen


Analizirane populacije koje nisu zastupljene
u pokusima provenijencija
Gospić, Gospić Jadovno -Jazbine
Gospić, Donji Lapac Lička Plješivica (S)


Gospić, Korenica Lička Plješivica (S)
Plitvička jezera Medveđak – Plitvički klanac
Delnice, Fužine Brloško
Gospić, Gračac Lička Plješivica (J)
Gospić, Gračac Velebit


dene lančane reakcije polimerazom dobiveni fragmenti
razdvojeni su elektroforezom. Haplotipovi su određeni
na osnovi razlike u veličini fragmenta, a svi navedeni
postupci obavljeni su u Laboratoriju za molekularnu genetiku
Šumarskog instituta, Jastrebarsko.


Prikupljanje uzoraka – Sample colection


Za kvalitetnu ekstrakciju DNA potreban je svjež
materijal, budući da stanica sadržava brojne enzime
koji se oslobađaju njezinim raspadanjem i razgrađuju
DNA. Iz tog razloga materijal za analizu mtDNA većinom
je sabran s pokusa provenijencija osnovanog u
rasadniku Instituta, koji je zbog blizine laboratoriju
najpogodniji. Provenijencije koje zbog nedostatka sadnica
nisu bile zastupljene u pokusu A-polje, uzete su iz
pokusa Brloško. Kako pokus provenijencija ne pokriva
cjelokupni areal obične jele u Hrvatskoj, uzorkovanje
provenijencija koje nisu zastupljene ni na jednom od
pokusa obavljeno je u prirodnim populacijama na području
četiri Šumarije Uprave šuma Podružnica Gospić
i s područja NP Plitvička jezera.


Od vremena sabiranja uzoraka do ekstrakcije DNA
iz prirodnih populacija grane u dužini od 50 do 60 cm
stavljene su u staklenke s vodom.


Jedinke s kojih su uzeti uzorci obilježene su u pokusima
i u prirodnim sastojinama. Udaljenost između stabala
u sastojinama bila je najmanje 100 m, a od svake
provenijencije skupljeno je po šest jedinki. Područje Šumarija
Donji Lapac i Korenica predstavlja provenijenciju
sjevernog dijela Ličke Plješivice te su sa svakog područja
uzeta po tri uzorka. Uzorci iz šumskih sastojina
analizirani su naknadno zajedno s nova tri uzorka provenijencije
Macelj. Ukupno je analizirano 136 stabala
obične jele, 126 iz Hrvatske i 10 iz Slovenije.


Izolacija stanične deoksiribonukleinske kiseline
Izolation of deoxyribonucleic acid (DNA)


Ukupna stanična DNA ekstrahirana je iz iglica proljetnih
izbojaka obične jele. Upotrijebljeno je 5–7 iglica
po stablu, ovisno o njihovoj veličini. Iglice su stavljene
u plastične epruvete od 2 ml i smrznute tekućim
dušikom te zdrobljene pomoću sterilnih plastičnih štapića.
Dobivenom prahu dodan je 1 ml ekstrakcijskog
pufera (Tablica 2.).


DNA molekule izolirane su protokolom prema
Doyleu i Doyleu (1987). Dobivena otopina inkubirana
je 60 minuta na 55 °C u inkubatoru uz povremeno
protresanje. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu
dodano je 400 ml diklormetana. Otopina je pažljivo
izmiješana okretanjem epruvete, jer se u slučaju prejakog
miješanja otopina nije mogla razdvojiti na faze.




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 28     <-- 28 -->        PDF

M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
više vrsta kritosjemenjača i mtDNA i cpDNA nasljeđuju
se po majčinskoj liniji (D u m o l in -L ap egu e i sur.
1998 prema Reboudu i Zeylu 1994). S druge strane,
kod golosjemenjača se kloroplasti prije oplodnje u jajnoj
stanici raspadaju (S a la j i sur. 1998) te se nasljeđuju po
muškoj liniji, a mitohondriji isključivo po ženskoj liniji
(Wagneru 1994 prema Liepelt i sur. 2002).


Iz navedenog je razvidno kako se mtDNA i cpDNA
nasljeđuju “klonski”, tj. uniparentalno bez rekombina


cije među genomima roditelja. Genomi oba organela
haploidni su i njihove genotipove nazivamo haplotipom.
Jedine promjene u DNA bilo da je riječ o mtDNA


ne pili cpDNA s
ssu
uu mutacije. Stoga se DNA tih dvaju staničnih
organela pokazala vrlo pogodnom za populacijskogenetička
istraživanja. Ti organeli omogućuju praćenje
širenja pojedinih vrsta golosjemenjača biparentalno:
prema kloroplastnoj DNA po muškoj liniji, a mitohondrijskoj
DNA po ženskoj roditeljskoj liniji.


Molekularno genetičke metode istraživanja
Molecular-genetic research methods


Danas u svijetu postoje vrlo pouzdane molekularno-
genetičke metode kojima se rješavaju praktični problemi
šumarstva vezani uz procjenjivanje genetske
raznolikosti, oplemenjivanje ili zaštitu šumskih genetskih
resursa (Franjić i Liber 2001). Unatoč tomu, u
hrvatskom šumarstvu istraživanja ovim metodama su u
samim počecima.


Krajem dvadesetog stoljeća, otkrićem i razvojem
tehnike PCR-a (Polymerase Chain Reaction – lančana
reakcija polimerazom), dolazi do unapređenja postojećih
molekularno-bioloških tehnika kao i otkrića novih.
Nadalje, osim istraživanja jezgrine DNK započinje se s
istraživanjima kloroplastne i mitohondrijske DNK.


Mogućnosti spontane hibridizacije kavkaske i obične jele
Spontaneous hybridisation possiblilities of Nordmann and Silver fir


Kavkaska jela (Abies nordmanniana /Steven/ Spach)
prirodno je rasprostranjena u planinama zapadnoga


Slika 1. Shematski prikaz križanja između osam vrsta roda Abies
(preuzeto od KORMUTAK 1997)


Figure 1 Shematic representation of hybridization between eight
Abies species (from KORMUTAK 1997)


Kavkaza i na Pontskom gorju sjeveroistočne Turske.
Raste na nadmorskoj visini (najčešće) od 800–1200 m,
a nalazimo je i na nižim (600 m) i višim (2200 m) predjelima.
Tvori čiste ili mješovite sastojine s vrstama Picea
orientalis, Fagus orientalis i Pinus sylvestris. Važno
je napomenuti da ju je u zapadnu Europu prvi puta
unio botaničar Nordmann 1838. godine. Otpornija je na
sušu od obične jele. Vrlo je dekorativna vrsta te se zbog
habitusa, lijepe piramidalne krošnje u koje se grane spuštaju
do zemlje, mnogo sadi po parkovima i nasadima
(Vidaković 1993).


Na Slici 1. shematski su prikazane mogućnosti križanja
osam vrsta roda Abies. Vidljivo je koje se vrste
križaju među sobom recipročno, koje samo u jednom
smjeru te između kojih vrsta jela križanje nije moguće.


Križanja pojedinih vrsta unutar roda Abies moguća
su i spontano se mogu odvijati u prirodi (Kormutak
1997). Obična jela uspješno je križana i s vrstama A.
veitchii, A. concolor, A. amabilis, A. numidica, A. pin-
sapo i A. homolepsis. Također, prema Loftingu u Danskoj
su nastali spontani križanci između obične i kavkaske
jele, a pojedini su pokazali posebno dobar rast
(Vidaković i Franjić 2004).


Križanja vrsta unutar roda Abies istraživali su K o r


mutak(1997), Kormutaki Vookova(2001), Vo


okova i Kormutak (2003).
i


MATERIJAL I METODE – Materials and methods
Osnovni podaci o provenijencijama – Basic provenance datta
aa


Uzorci za analizu mtDNK sakupljeni su većinom u tuta “A-polje». Manji dio uzorkovan je u prirodnim
pokusima provenijencija obične jele, osnovanih na populacijama obične jele.
području Šumarije Fužine “Brloško» i rasadniku Insti




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 27     <-- 27 -->        PDF

IZVORNI ZNANSTVENI ČLANCI ORIGINAL SCIENTIFIC PAPERS Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
UDK 630* 165 (001)


MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE
(Abies nordmaniana /Steven/ Spach) U ŠUME OBIČNE JELE
(Abies alba Mill.) MACELJA I TRAKOŠĆANA


POSIBILITY OF GENETICAL INTROGRESION OF NORDMANN FIR
(Abies nordmaniana /Steven/ Spach) IN COMMON FIR FORESTS
(Abies alba Mill.) OF MACELJ AND TRAKOŠĆAN


Mladen IVANKOVIĆ*


SAŽETAK: U radu su prikazani rezultati molekularnih istraživanja varijabilnosti
obične jele. Upotrebom PCR-a analizirana je mitohondrijska DNA
(mtDNA), fragment DNA gena nad5-4. Istraživanja su provedena na biljkama
iz 25 hrvatskih provenijencija i dvije slovenske provenijencije obične jele.
Provedenim istraživanjem pronađena su dva haplotipa obične jele, apeninski
i balkanski.


Kod biljaka iz provenijencija Macelj i Trakošćan pronađeni su haplotipovi
kavkaske jele, koja je najvjerovatnije unesena sadnjom sadnica, te je slobodnim
križanjem s običnom jelom došlo do daljnje introgresije gena kavkaske
jele u tamošnje populacije.


K l j u č n e r i j e č i : obična jela, kavkaska jela, mtDNA, introgresija


UVOD – Introduction
Obična jela je uz hrastove i običnu bukvu temeljna, ne jele u Europi rađena u sklopu projekta Europske
klimatogena vrsta drveća u Hrvatskoj (Matić 2001). unije (FOSSILVA), kao i neka druga, ukazuju na mije-
Uz hrast lužnjak spada u najznačajnije šumske vrste na-šanje balkanskih i apeninskih haplotipova upravo na
ših šuma. U drvnoj zalihi sudjeluje s 9,4 %, a ostale vrste području areala obične jele u Hrvatskoj (L i e p el t i dr.
crnogorice (smreka, alepski bor, crni bor, obični bor, pri2002,
Ballian i Kajba 2005) posebice u području
morski bor, ariš, duglazija i dr.) s 5,2 % (Pr p i ć 2001). Gorskog kotara.
Istraživanja genetske raznolikosti molekularno-bio-Cilj istraživanja je analizom mtDNA obične jele
loškim i biokemijskim metodama (cpDNA – kloro-utvrditi genetsku varijabilnost obične jele na području
plastna deoksiribonukleinska kiselina, mtDNA – mito-prirodne rasprostranjenosti u Hrvatskoj i dijelu Slovehondrijska
deoksiribonukleinska kiselina, izoenzimi) nije. Ovakva su istraživanja korisna za sve poslove veprovenijencija
obične jele kod nas nisu do sada rađena. zane za oplemenjivanje i uzgoj obične jele te očuvanje
Međutim, rezultati istraživanja cpDNA i mtDNA obič-njenog genofonda metodama in situ i ex situ.


Mitohondrijska DNA (mtDNA) i njezino nasljeđivanje kod biljaka
Mitochondrion DNA (mtDNA) and its inheritance in plants


Stanica, osnovna jedinica života, sadrži stanične or-Mitohondriji su pronađeni u gotovo svim eukariotganele
koje su membranama odvojene od ostalih dijeskim
stanicama. To su ovalni organeli duljine 1 do 3 µm
lova stanice: jezgru, ribosome, mitohondrije, endo-i širine 1 µm (Buchanan i sur. 2001) koji maju svoj
plazmatski retikulum, Golgijev aparat, lizosome, a u vlastiti genom (vlastitu DNK). Biljni mitohondriji, pobiljkama
kloroplasti i vakuole. put mitohondrija svih eukariota, sadržavaju veći broj


kružnih dvolančanih DNA molekula.
Nasljeđivanje DNA iz organela stanica ne odvija se


* Dr. sc. Mladen Ivanković, Odjel za oplemenjivanje i šumsko
sjemenarstvo, Šumarski institut, Jastrebarsko kod svih biljaka i organela jednako. Na primjer, kod naj




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 35     <-- 35 -->        PDF

M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
LITERATURA – References


B al l ia n, D., D. K a j b a , 2005: Estimation of the isoenzyme
genetic variability of the silver fir
(Abies alba Mill.) from the area of Gorski kotar
(Croatia). Periodicum biologorum Vol. 107, No.
1 67–72.


Buchanan, B. B., W. Gruissem, R. L. Jones,
2001: Biochemistry & Molecular Biology of
Plants, American Society of Plant Physiologists;
Rockville, Maryland.


Doyle, J. J., J. L. Doyle, 1987: A rapid DNA isolation
procedure for small quantities of fresh leaf
tissue, Phytochemistry Bulletin 19:11–15.


Dumolin-Lape gue, M.-H. Pemonge, R. J. Petit
, 1998: Association Between Chloroplast and
Mitochondrial Lineages in Oaks; Mol. Biol.
Evol. 15 (10): 1321–1331.


F r a n j ić , J., Z. L i b e r , 2001: Molekularna biologija
u šumarstvu. Šumarski list. 9–10/2001 Zagreb,
495–500.


Gömoöry, D., R. Longauer, S. Liepelt, D.
B a l l i a n , R. Bru s , H. K r a i g h e r , V. I. P a r pan,
Taras V. Parpan, L. Paule, V. I. Stu-
par, B. Ziegenhagen, 2004: Variation patterns
of mitochondrial DNA of Abies alba Mill.
Insuture zones of postglacial migration in Europe.
Acta Societatis Botanicorum Poloniae Vol.
73, No. 3: 203–206, 2004.


Gračan, J., 2001: Dostignuća na oplemenjivanju obične
jele; Obična jela u Hrvatskoj. Akademija šumarskih
znanosti i “Hrvatske šume” PO Zagreb:
334–338, Zagreb.


I v a n ko v i ć , M., 2003: Varijabilnost nekih svojstava
obične jele (Abies alba Mill.) u pokusu provenijencija
»Brloško»; Magistarski rad, Šumarski
fakultet, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb 2003.


K o r mut ž ak, A., 1997: Cytological aspects of interspecific
hybridization in true firs (Abies species).
Cytogenetic studies of forest trees and shrub spe


cies Eds Ž. Borzan & Schlarbaum S.E. Proc. First
IUFRO Cytogenetics Working Party S2. 04–08,
1993 Brijuni National Park Croatia 303–310.


Kormutžak, A., B. Vookova, 2001: Early growth
characteristics of some Abies hybrids. In: Genetic
Response of Forest Systems to Changing Enviromental
Conditions (Eds. Muller-Starck, M.,
Schubert, R) Kluwer Academic Publishers, London-
Dordrecht-Boston-London, 331–338.


Li e p e l t, L., R. B i a l o z y t , B. z i e g e n h a g e n ,
2002: Wind-dispersed pollen mediates postglacial
gene flow among refugia.


Matić, S., 2001: Proslov; Obična jela u Hrvatskoj.
Akademija šumarskih znanosti i “Hrvatske šume”
p o Zagreb: Zagreb, 5–8.


Prpić, B., 2001: Uvod; Obična jela u Hrvatskoj. Akademija
šumarskih znanosti i “Hrvatske šume” p o
Zagreb: 12–17.


Salaj, J., A. Kosová, A. Kormuták, B. Walles,
1998: Ultrastructural and molecular study of
plastid inheritance in Abies alba and some Abies
hybrids, Sexual Plant Reproduction, 11 (5):
284–291.


Vidaković, M., 1993: Četinjače – morfologija i varijabilnost.
II prošireno izdanje Grafički zavod
Hrvatske i “Hrvatske šume”, p o Zagreb.


Vidaković, M. i J. Franjić, 2004: Golosjemenjače.
Udžbenici Sveučilišta u Zagrebu, Šumarski
fakultet, Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb 2004.


Vookova, B., A. Kormutak, 2003: Plantlet Regeneration
in Abies cilicica Carr. And Abies cilicica
x Abies nordmanianna Hybrid via Somatic
Embryogenesis. Turk J Bot 27 (2003) 71–76.


Ziegenhagen, B., B. Fady, V. Kuhlenkamp, S.
Liepelt, 2005: Diferentiating Groups of Abies
Species With a Simple Molecular Marker. Silvae
Genetica 54 (3): 123-126.


SUMMARY: European fir (Abies alba Mill.) is one of the most significant
forest species of the Republic of Croatia. This paper presents research results
of variability of mitohondrial DNA (mtDNA) fragment nad5-4.


By the use of molecular methods and PCR, two halotypes of European fir
were found within the distribution range for this species in Croatia and a part
of Slovenia.


In provenances Macelj and Trakošćan, haplotypes of Nordmann’s silver
fir (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) were found and it is most likely that it
was introduced by planting of seedlings and that further introgression of
Nordmann´s silver fir genes into local population occurred through random
cross-breeding with European fir.




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 34     <-- 34 -->        PDF

M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
nova uzorka provenijencije Macelj jedan uzorak odgovara
kavkaskoj jeli, dok mtDNA druga dva uzorka
odgovara haplotipu 2 obične jele.


Za uzorak iz Trakošćana i uzorak iz Macelja koji je
fenotipski sličan običnoj jeli, a dužina umnoženog
fragmenta mtDNA odgovara kavkaskoj jeli (mtDNA
nasljeđuje se isključivo po majci), možemo zaključiti
da se radi o hibridu A. nordmanniana × A. alba.


Kako je u ovom radu analizirana samo mtDNA, ne
možemo isključiti postojanje još većeg broja hibrida
koje bismo možda otkrili analizirajući cpDNA, jer se
cpDNA četinjača nasljeđuje po očinskoj liniji. Također,
nemožemo isključiti ni eventualnu introgresiju gena
kavkaske jele u genom obične jele, do koje je moglo doći
križanjem spontanih hibrida sa čistom običnom jelom.


Slika 8. Postotni udio haplotipova alela 2 i alela 3 (kavkaske jele) u populacijama Trakošćan i Macelj
Figure 8 Percentages of haplotypes of alels 2 and 3 (kavkaske jele) in Trakošćan and Macelj populations


Iz svega navedenog nameće se vrlo važan zaključak


o primjenjivosti molekularnih metoda u šumarskim istraživanjima,
očuvanju genofonda, konzervaciji – očuvanju
(in-situ i ex-situ) kao i u operativnom šumarstvu –
sjemenarstvu (kontroli sjemena) i rasadničarstvu (kontrola
sadnog materijala).
Također, molekularne metode istraživanja bile bi neophodne
kod izrada studija utjecaja alohtone vrste koja
se spontano križa s autohtonom vrstom, dakle, kod izučavanja
introgresije gena strane vrste prilikom spontane
hibridizacije te utjecaja na okoliš, u prvom redu na šumske
ekosustave Republike Hrvatske. Pogotovo kada je
riječ o unesenoj vrsti (kavkaska jela) otpornijoj od autohtone
vrste (obična jela) na sušu koja je s obzirom na
klimatske promjene u adaptacijskoj prednosti. A. nordmanniana
obilno plodonosi i to već u dobi od 30 do 40
godina. Puni joj je urod svake 2–3 godine, dok obična


ZAKLJUČCI


1.
Molekulama analiza mtDNA obične jele (Abies
alba Mill.) gena nad5-4, utvrdila su u hrvatskim
provenijencijama postojanje haplotipa 1, karakterističnog
za srednju i zapadnu Europu, i haplotipa 2,
karakterističnog za jugoistočnu Europu. U dvije istraživane
slovenske provenijencije pronađen je samo
haplotip 1.
2.
Ovim istraživanjem u populacijama Trakošćan i
Macelj evidentirani su hibridi kavkaske i obične
jele (A. nordmanniana x A. alba). Ovi hibridi nastajela
počinje cvasti između 60. i 70. godine s punim urodom
svake treće do osme godine.


Tome u prilog idu i najnovija istraživanja (Zi eg en-
h a g en i sur. 2005) na identifikaciji 9 srodnih vrsta roda
Abies upotrebom nad5-4 introna, koji smo koristili i u
ovim istraživanjima. Navedena istraživanja provedena
su na sljedećim vrstama Abies alba, A. bornmuelleriana,
A. cephalonica, A. cilicica, A. concolor, A. nordmanniana,
A. equi-trojana, A. numidica i A. pinsapo.


I dok se danas vrlo često postavlja pitanje o utjecaju
GMO (genetski modificiranih organizama) na okoliš, o
takvim ili sličnim problemima, gdje je autohtona vegetacija
na neki način inferiorna alohtonoj vegetaciji, uopće
se ne vodi računa. Na temelju vrlo dostupnih molekularnih
analiza mogla bi se istražiti introgresija gena kavkaske
jele u Maceljskom gorju, te bi se takav način istraživanja
mogao primijeniti i na druge slične probleme.


Conclusions


li su spontanim križanjem unešene kavkaske jele s


domaćom običnom jelom.


3.
Primjenjivosti molekularnih metoda u šumarskim
istraživanjima, očuvanju genofonda, sjemenarstvu i
rasadničarstvu je neupitna. Ovim istraživanjem pokazalo
se također, da su molekularne metode vrlo
korisne kod izrada studija utjecaja alohtone vrste,
koja se spontano križa s autohtonom vrstom, odnosno
prilikom izučavanja introgresije gena strane
vrste u šumske ekosustave Republike Hrvatske.