DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 30 <-- 30 --> PDF |
M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537 Tablica 2. Sastav ekstrakcijskog pufera Table 2 Composition of extraction buffer o posi Tvar substance ATMAB NaCl 5 M EDTA0,5 M, pH-8,0 Tris HCl 1 M, pH-8,0 PVP dH O Ditiotreitol* r Količina quantity 20 g 280 mL 40 mL 100 mL lO do 1 L 0,3 g na 40 mL pufera * Ditiotreitol je dodan nakon autoklaviranja, jer se autoklaviranjem raspada. – Dithiotreitol is added after autoclaving, because it is otherwise degraded. Centrifugiranjem na 13000 okretaja u trajanju od 10 minuta odvojile su se tri faze: gornja vodena, srednja s čvr- Slika 2. Odvojene tri faze nakon centrifugiranja na 13000 okretaja u minuti Figure 2 3 separated phases after centrifugation on 1300 rpm Slika 3. Istaložene molekule nukleinskih kiselina Figure 3 Pelet of nucleic acids stim ostacima stanica i tkiva, te donja faza u kojoj je diklormetan (Slika 2.). Gornja, vodena faza otpipetirana je u čistu epruvetu. Zbog ostataka smole u vodenoj fazi postupak odjeljivanja diklormetanom proveden je dva puta. Vodenoj fazi je dodano 2/3 volumena (400–450 µl) hladnog izopropanola (–20 °C). Otopina je inkubirana 60 min na –20 °C, nakon čega su se centrifugiranjem na 13000 okretaja po minuti u trajanju od 10 min istaložile molekule nukleinskih kiselina (Slika 3.). Tekuća je faza izdvojena iz epruvete, a talog nukleinskih kiselina ispran s 1 ml 76 %-tnog etanola. Nakon 45 minuta sušenja dodano je 105 µl sterilizirane deionizirane vode. Tako dobivena matična otopina nukleinskih kiselina (stock solution) čuvana je na –20 °C. Prisutnost RNA molekula zajedno s DNA molekulama nije smetala pri daljnjoj analizi. Lančana reakcija polimerazom (PCR) - Polymerase chain reaction (PCR) Lančana reakcija polimerazom (PCR) jedna je od tehnika molekularne biologije koja se koristi za umnožavanje određenog dijela DNA. Sam postupak odvija se u posebno izrađenim uređajima, koji reakcijsku otopinu zagrijavaju i hlade na određene temperature u određeno vrijeme i u točno određenim ciklusima. Postupak ne bi bio moguć bez termostabilnih polimeraza koje se izoliraju iz termofilnih mikroorganizama. Najčešće korištena termostabilna polimeraza je Taq (polimeraza izolirana iz bakterije Thermus aquaticus). Radi se o termofilnoj bakteriji prvotno pronađenoj u Yellowstone- u, čiji je životni optimum na 70 C (50 C – 80 C) oo o (www.bact.wisc.edu/Bact303/b27). Postupak odvijanja PCR-a je sljedeći: U 95 µl sterilne destilirane vode dodano je pet µl matične otopine nukleinskih kiselina (5 % razrjeđenje). Otopina za umnožavanje DNA fragmenata sadržavala je: > početnice za nad5-4 fragment .Ta q DNApolimerazu Čdeioniziranu vodu i Č razrijeđenu otopinu nukleinskih kiselina 2x pufer pripremljen je unaprijed, a njegov sastav na veden je u Tablici 3. Slijed nukleotida početnica je: 5’-GGACAATGACGATCCGAGATA-3’, odnosno 5’ -CATCCCTCCCATTGCATTAT-3’. Njima je umnožen fragment DNA gena nad5-4. Smjesa za amplifikaciju pripremljena je za ukupni broj uzoraka s kojim se radilo, s time da je ukupni volumen po uzorku bio 25 µL (Tablica 4.). |