DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 30     <-- 30 -->        PDF

M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
Tablica 2. Sastav ekstrakcijskog pufera
Table 2 Composition of extraction buffer


o posi
Tvar
substance


ATMAB
NaCl 5 M
EDTA0,5 M, pH-8,0
Tris HCl 1 M, pH-8,0
PVP


dH O


Ditiotreitol*


r


Količina


quantity


20 g
280 mL
40 mL
100 mL


lO


do 1 L
0,3 g na 40 mL pufera


* Ditiotreitol je dodan nakon autoklaviranja, jer se autoklaviranjem
raspada. – Dithiotreitol is added after autoclaving,
because it is otherwise degraded.
Centrifugiranjem na 13000 okretaja u trajanju od 10 minuta
odvojile su se tri faze: gornja vodena, srednja s čvr-


Slika 2. Odvojene tri faze nakon centrifugiranja na 13000 okretaja
u minuti
Figure 2 3 separated phases after centrifugation on 1300 rpm


Slika 3. Istaložene molekule nukleinskih kiselina
Figure 3 Pelet of nucleic acids


stim ostacima stanica i tkiva, te donja faza u kojoj je
diklormetan (Slika 2.). Gornja, vodena faza otpipetirana
je u čistu epruvetu. Zbog ostataka smole u vodenoj
fazi postupak odjeljivanja diklormetanom proveden
je dva puta. Vodenoj fazi je dodano 2/3 volumena
(400–450 µl) hladnog izopropanola (–20 °C).


Otopina je inkubirana 60 min na –20 °C, nakon
čega su se centrifugiranjem na 13000 okretaja po
minuti u trajanju od 10 min istaložile molekule
nukleinskih kiselina (Slika 3.). Tekuća je faza izdvojena
iz epruvete, a talog nukleinskih kiselina ispran s 1
ml 76 %-tnog etanola.


Nakon 45 minuta sušenja dodano je 105 µl sterilizirane
deionizirane vode. Tako dobivena matična otopina
nukleinskih kiselina (stock solution) čuvana je na
–20 °C. Prisutnost RNA molekula zajedno s DNA molekulama
nije smetala pri daljnjoj analizi.


Lančana reakcija polimerazom (PCR) - Polymerase chain reaction (PCR)


Lančana reakcija polimerazom (PCR) jedna je od
tehnika molekularne biologije koja se koristi za umnožavanje
određenog dijela DNA. Sam postupak odvija
se u posebno izrađenim uređajima, koji reakcijsku otopinu
zagrijavaju i hlade na određene temperature u
određeno vrijeme i u točno određenim ciklusima. Postupak
ne bi bio moguć bez termostabilnih polimeraza
koje se izoliraju iz termofilnih mikroorganizama. Najčešće
korištena termostabilna polimeraza je Taq (polimeraza
izolirana iz bakterije Thermus aquaticus). Radi
se o termofilnoj bakteriji prvotno pronađenoj u Yellowstone-
u, čiji je životni optimum na 70 C (50 C – 80 C)


oo o


(www.bact.wisc.edu/Bact303/b27).


Postupak odvijanja PCR-a je sljedeći:


U 95 µl sterilne destilirane vode dodano je pet µl
matične otopine nukleinskih kiselina (5 % razrjeđenje).
Otopina za umnožavanje DNA fragmenata sadržavala
je:


> početnice za nad5-4 fragment
.Ta q DNApolimerazu


Čdeioniziranu vodu i
Č razrijeđenu otopinu nukleinskih kiselina
2x pufer pripremljen je unaprijed, a njegov sastav na


veden je u Tablici 3.


Slijed nukleotida početnica je:
5’-GGACAATGACGATCCGAGATA-3’, odnosno
5’ -CATCCCTCCCATTGCATTAT-3’.


Njima je umnožen fragment DNA gena nad5-4.
Smjesa za amplifikaciju pripremljena je za ukupni broj
uzoraka s kojim se radilo, s time da je ukupni volumen
po uzorku bio 25 µL (Tablica 4.).