DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu




ŠUMARSKI LIST 11-12/2007 str. 32     <-- 32 -->        PDF

M. Ivanković: MOGUĆNOST INTROGRESIJE GENA KAVKASKE JELE (Abies nordmaniana /Steven/ Spach) . Šumarski list br. 11–12, CXXXI (2007), 529-537
Određivanje veličine fragmenata – Detection of fragment sizes


Produkti dobiveni lančanom reakcijom polimeraze
analizirani su uređajem 2100 Bioanalyzer tvrtke Agilent
Technologies (Slika 6.).


Slika 6. 2100 Bioanalyzer tvrtke Agilent Technologies
Figure 6 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies


Analiza se odvijala na “chipu” (DNA 1000 lab-chip
kit) na koji se stavi gel, boja koja se veže na DNAi 1 µl
uzorka umnožene DNA. U jednu od jažica stavi se lje


stvica (ladder) koja sadrži fragmente DNA poznatih
veličina od 25 pb* do 1,5 kb**. U sve ostale jažice
stavlja se unutrašnji biljeg od 25 pb i 1,5 kb. Uređaj sadržava
detektor koji registrira vrijeme izlaska molekule
DNA. Na osnovi veličine fragmenata u jažici s ljestvicom
i vremena njihova izlaska, uređaj računa veličinu
molekula DNA u uzorcima. Biljeg u uzorcima pomaže
njihovu pravilnom smještanju u raspon od 25 do
1500 pb. Uređaj bilježi veličinu svakog od fragmenata
u parovima baza te može simulirati i izgled gela.


Lančanom reakcijom polimeraze (PCR) umnožen je
po jedan fragment DNA u svakom uzorku. Na osnovi
veličine umnoženog fragmenta određen je haplotip jedinke
u skladu s prethodnim istraživanjem (Lie pe l t i
sur. 2002, Gömöry i sur. 2004). Veći fragment označen
je brojem 1, a manji brojem 2. Kod određenog broja
uzoraka utvrđen je novi fragment od približno 450 pb,
kojem je naknadno određen slijed nukleotida označen je
brojem 3.


Fragment 3 sekvenciran je u laboratoriju VBCGENOMICS
GmbH u Beču. Pretragom javne baze
podataka Entrez Nucleotide na internet stranicama
NCBI-a (National Center for Biotechnology Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) određena
je vrsta kojoj pripada navedeni fragment.


REZULTATI I RASPRAVA


Od dvadeset sedam obrađenih provenijencija obične
jele iz Hrvatske i Slovenije, deset ih sadržava samo
dulji fragment (Rudač, Bistranska gora, Djedovica-
Trešnjevica, Mašun, Podturen, Gospić, Donji Lapac,
Korenica, NP Plitvička jezera i Gračac-Velebit). Dulji
fragment odnosno alel 1, karakterističan je za središnju
i zapadnu Europu. Samo kraći fragment (alel 2) karakterističan
za jugoistočnu Europu nalazimo u devet populacija
(Gluhe Drage, Belevine, Nadžak bilo, Biokovo,
Brloško, Rudač 2a, Alilovica, Rastovka i Duliba).
Šest provenijencija: Zapadni Papuk, Rudnik, Josipovac,
Potočine Crna kosa, Miletka i Gračac-Lička Plješivica
sadržavaju oba haplotipa. U njima u različitim
omjerima nalazimo oba alela.


Odstupanje je dobiveno za šest uzoraka iz populacije
Macelj i za jedan uzorak iz populacije Trakošćan.
Prosječan broj parova baza dobivenog fragmenta iznosio
je približno 450 pb. Utvrđivanjem slijeda nukleotida
toga fragmenta i usporedbom s podacima iz baze
podataka (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) ustanovljeno
je da 450 pb dugi fragment odgovara fragmentu
Nad5-4 kavkaske jele.


* pb = par baza;
** kb = kilo baza = 1000 pb
Results and discussion


Na Slici 6. dan je prikaz slijeda nukleotida četvrtog
introna pete podjedinice NAD dehidrogenaze
(nad 5-4). Razlika u duljini fragmenata haplotipa 2 i
haplotipa 1 je 80 pb (Slika 7.). Na prikazu slijeda nukleotida
insercija je označena crvenom bojom. A.
nordmanniana ima dodatnu sekvencu, na prikazu
označenu plavom bojom, ubačenu (insertiranu) neposredno
iza insercije haplotipa 1. Obje insercije započinju
sekvencom tagatatat.