DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu
| ŠUMARSKI LIST 11-12/2011 str. 12 <-- 12 --> PDF |
O. Tančeva Crmarić, S. Štambuk, Z. Šatović, D. Kajba: GENOTIPSKARAZNOLIKOST DIVLJE TREŠNJE ... Šumarski list br. 11–12, CXXXV (2011), 543-555 Ti su biljezi odabrani od organizacije ECPGR po načelima dva mikrosatelitna biljega po kromosomu za rodPrunusi bazirani na brojnim mjerilima: publicirani su i slobodno dostupni; razvijeni su zaPrunus avium (isključujući UDPA98-412 i PceGA34); imaju jednostavan model amplifikacije, jedan do dva alela po diploidu; polimorfni su sa visokim PIC (Informacijski sadržaj polimorfizma) i DP vrijednostima; odsustvo null alela; distribuirani su kroz genom, nisu strogo vezani i imaju mogućnost za multiplex istraživanja (http://www.ecpgr.cgiar.org/networks/fruit/prunus.html) . Lančana reakcija polimerazom kao tehnika molekularne biologije koristi se za umnožavanje točno određenog dijela DNA. Za izvođenje ove reakcije korišten je uređaj GeneAmp. PCR System 9700 koji omogućava zagrijavanje i hlađenje reakcijske otopine na određenim temperaturama u određeno vrijeme. Produkti PCR analizirani su u automatskom kapilarnom sekvencioneru (ABI Prism 310 GeneticAnalyzer, Software v. 3.2., Applied Biosystems) koji za htije va fluorescentno označene primere. Kapilare u polju istosmjerne struje omogućavaju razdvajanje DNAfragmenata prema veličini. Detekcija DNAfragmenata bazira se na karakteristici da specijalne fluorescentne boje osvijetljene laserom emitiraju svjetlost. Sekvencioner može detektirati istovremeno pet boja (pla vu, zelenu, crvenu, žutu i narančastu). Narančasta bo ja se koristi za interni standard (upotrebom Genescan 500 Liz internal size standard –Applied Biosystems) pozna tih veličina fragmenata, a kojim se so f tverski određivala duljina ostalih fragmenata. Raznolikost mikrosatelitnih biljega analizirana je na temelju izračuna ukupnog broja alela po biljegu (Na ), ukupnog broja genotipova po biljegu (Ng), zapažene heterozigotnosti (HO), očekivane heterozigotnosti ili genske raznolikosti (HE), te Informacijskog sadržaja polimorfizma (PIC). Izračuni navedenih parametara izračunati su pomoću računalnih programa PowerMarker V3.23 (Liu, 2002), FSTAT v. 2.9.3.2 programme package (Goudet 1995, 2002) i MICROSAT (Minch i sur. 1997). Ishodišna matrica umnoženih fragmenata 15 mikrosatelitnih biljega korištena je u izračunavanju matrice genetske udaljenosti na temelju udjela zajedničkih alela (Proportion of Shared Alleles Distance; DPSAM) (Bowcock i sur.1994). Dobivena matrica poslužila je za izradu stabla metodom sparivanja susjeda (Neighbor- Joining; NJ) (Saitou iNei1987). Računalni program MICROSAT korišten je za izračun genetske udaljenosti na temelju udjela zajedničkih alela (DPSAM)kao i za izradu 1,000 pseudoponavljanja bootstrap uz izračun pripadajućih matrica genetske udaljenosti. Izrada stablaNJprovedena je pomoću računalnog programa NEIGHBOR programskog paketa PHYLIP (Felsenstein 2002). Vrijednosti bootstrapizračunate su pomoću računalnog programa CONSENSE (PHYLIP). U svrhu grafičkog prikaza odnosa između analiziranih genotipova provedena je faktorijalna analiza korespondencije (Factorial Correspondence Analysis; FCA). FCAje multivarijatna metoda koja se koristi u svrhu sažimanja informacija i prikaza odnosa između opažaja (jedinki) na temelju simultane analize više kvalitativnih svojstava (biljega). FCAje sličnaAnalizi glavnih sastavnica (Principal Component Analysis; PCA) pri čemu se PCAkoristi u slučaju kvantitativnih svojstava, dok se FCAtemelji na tablicama kontingencije nastalih unakrsnim tabeliranjem (cross-tabulation). FCA je provedena pomoću programa Genetix 4.05 (Belkhir i sur. 2004) uzimajući u obzir regionalnu pripadnost jedinki u analizi. Analizom molekularne varijance (Analysis of Molecular Variance; AMOVA;Excoffier i sur.1992) raščlanjena je ukupna varijanca u sastavnice varijance: sastavnicu uzrokovanu razlikama između regija (Bjelovar, Koprivnica, Zagreb), te sastavnicu uzrokovanu razlikama između jedinki unutar regija.Analiza je provedena uz pomoć programa Arlequin ver. 2.000 (Schne i der isur.,2000), a signifikantost. vrijednosti izračunata je na temelju 10 000 permutacija. Pojedinačnim analizama izračunate su.ST vrijednosti između svih parova regija uz izračun njihovih signifikantnosti. Tako je dobivena matrica .ST vrijednosti na temelju koje je moguće procijeniti udaljenost između analiziranih regija. REZULTATI ISTRAŽIVANJAI DISKUSIJA– Results of research and disscusion Procjena genetske raznolikosti Istraživana fenotipski odabrana 24 plus stabla divlje trešnje pripadaju trima sjemenskim regijama, od toga regiji Zagreb pripadaju 13, regiji Bjelovar četiri i regiji Koprivnica sedam genotipova. Utvrđeno je bogatstvo alelnih varijacija kod SSR lokusa, te je potvrđena cjelokupna značajna genetička raznolikost istraživanih klonova divlje trešnje. Unutar navedenih 15 lokusa, u ovom istraživanju detektirano je 100 različitih alela –Estimation of genetic variability kod 24 istraživanih klonova divlje trešnje. Odabrani SSR biljezi ugenotipizaciji klonova pokazali su se kao jako informativni materijal. U dosadašnjim istraživanjima SSR biljezi korišteni su za fingerprinting, mapiranje, kao i za određivanje protoka gena (Vaughan i Russell2004,Clarki sur.2009). Od odabranih 15 biljega njih 14 je pokazalo 100 %-tnu amplifikaciju kod svih 24 odabranih klonova divlje treš |