DIGITALNA ARHIVA ŠUMARSKOG LISTA
prilagođeno pretraživanje po punom tekstu



ŠUMARSKI LIST 5-6/2017 str. 54     <-- 54 -->        PDF

referenci ne može se sa sigurnošću potvrditi tko ju je prvi put zabilježio i gdje na području Hrvatske (Fabre 1976; Coeur d’acier i dr. 2010).
U jesen 2012. godine Zavod za javno zdravstvo Istarske županije zaprimio je dojavu o neuobičajenoj masovnoj pojavnosti nepoznatih vrsta kukaca uočenih na zidovima višestambenog objekta, na terasama, ali i u unutrašnjim prostorima objekta nakon ulaza kroz otvorene prozore s grana libanonskog cedra. Preliminarni pregled materijala pokazao je da se najvjerojatnije radi o jednoj od vrsta biljnih ušiju iz roda Cinara.
Cilj ovog rada je precizno određivanje vrste biljne uši nađene u Istri na temelju analize morfoloških i molekularnih značajki.
MATERIJALI I METODE
MATERIALS AND METHODS
Na poziv vlasnika objekta, u Puli, ul. P. Budicin br. 25., o pojavi neuobičajenih kukaca uzet je uzorak (slika 1.) te je materijal pregledan pod entomološkom lupom i fotografiran.
Uzorci uzeti tijekom prvog nalaza pregledani su entomološkom lupom u Zavodu za javno zdravstvo Istarske županije Olimpus SZX9 i fotografirani na lupi Olympus 5.0 i na 3D lupi Stereo-mikroskop Discovery V20, Zeiss Hrvatskog veterinarskog instituta, gdje su i precizno izmjereni (Slika 2.).
Budući da morfološka analiza nije bila u potpunosti sigurna (Blackman 2006, Poljaković-Pajnik 2002) napravljena je DNA analiza u laboratoriju Hrvatskog prirodoslovnog muzeja u Zagrebu.
Kroz 2013., 2014. i 2015. godinu proveden je povremeni monitoring na 10 libanonskih cedrova na području grada Pule (Ul. Pino Budicin k. br. 25. – 1 stablo, Ul. Pino Budicin k. br. 4. – 1 stablo, Ul. Pino Budicin k.br. 1. – 2 stabla, Mornarički park – 2 stabla, B. Kosa k. br. 16. – 1 stablo, park Montezaro – 2 stabla i Park pod Arenom – 1 stablo). Uz pregledavanje grana i kore debla uzeti su i uzorci zemlje i opalih iglica i pregledavani pod entomološkom lupom.
Molekularna identifikacija – Molecular identification
Ukupna genomska DNA izolirana je pojedinačno iz dvije jedinke korištenjem komercijalnog kompleta PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen) i eluirana u 50 µl pufera za eluaciju.
Molekularno-genetička determinacija nepoznatih uzoraka provedena je metodom DNA barkodiranja usporedbom s ranije karakteriziranim vrstama roda Cinara i to na temelju filogenetske analize sekvenci dostupnih u banci gena (226 sekvenci, 56 vrsta, pristupni brojevi u banci gena: KF649338, KF649340, KF649342 – KF649355, KF649357 – KF649565 i KJ433268, Jousselin i dr. 2013; Yu i Wang 2014), kao i korištenjem analitičkih alata i sekvenci platforme BOLD (1265 sekvenci, 99 vrsta; Barcode of Life Database System, www.boldsystems.org).
Metodologija DNA barkodiranja predložena je 2003. godine kao univerzalni sustav za determinaciju biološkog materijala u smislu identifikacije vrste u svim razvojnim stadijima, ali također i kao oruđe za otkrivanje novih tzv. kriptičnih vrsta koje se ne mogu međusobno razlikovati na temelju morfoloških karakteristika (Hebert i dr. 2003). Pri tome se određuje slijed nukleotida standardiziranog fragmenta mitohondrijskog (mt) gena za podjedinicu jedan citokrom c oksidaze (COI) dužine oko 650 pb tzv. DNA barkod regija.
Za obje jedinke, lančanom reakcijom polimeraze (PCR) umnožena je DNA barkod regija uporabom LCO1490: 5’-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3’ i HCO2198: 5’-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3’ (Folmer i dr. 1994) PCR početnica. Reakcijska smjesa od 50 µl sadržavala je pufer (Go Taq®Reaction Buffer, Promega), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM svakog dNTP-a, 0,4 µM obje početnice, 1,25 u Taq polimeraze (Go Taq®DNA Polymerase, Promega) te 4 µl eluata genomske DNA. Uvjeti PCR reakcije obuhvaćali su početnu denaturaciju od 2 min na 94oC, zatim 35 ciklusa naizmjenične denaturacije (94oC / 30 s), sparivanja (50oC / 30 s) i elongacije (72oC / 1 min 30 s), nakon čega je slijedila završna elongacija na temperaturi od 72oC u trajanju od 7 minuta. Određivanje slijeda nukleotida provedeno je u servisu za sekvencioniranje (Macrogen Inc, Korea) uporabom LCO1490 (uzorak CINC1) i HCO2198 (uzorak CINC2) početnica.
Sekvence DNA barkod regije vrsta roda Cinara povučene iz banke gena sravnjene su s dvije sekvence iz ovog istraživanja uporabom opcije „ClustalW Multiple sequnce Alignment“ u programu BioEdit v.7.1.3 (Hall 1999).
Genetičke udaljenosti izračunate su u računalnom programu MEGA (verzija 6, Tamura i dr. 2013) korištenjem K2P (Kimura two-parameter) evolucijskog modela. Ovaj evolucijski model uobičajeno se koristi za određivanje genetičkih udaljenosti u studijama barkodiranja (Coeur d’acier i dr. 2014) te je odabran da bi se mogli uspoređivati rezultati ovog i prijašnjih istraživanja.
Filogenetska analiza provedena je Bayesian metodom (3 000 000 generacija uz uzorkovanje svake tisućite generacije te odbacivanje prvih 20 % stabala) uz pomoć računalnog programa MrBayes (version 3.1.2, Ronquist i Huelsenbeck 2003). Evolucijski model koji najbolje odgovara setu podataka, TPM3uf+I+G, prethodno je odabran računalnim programom jModelTest 0.1.1 (Posada 2008) uporabom Bayesian informacijskog kriterija. COI sekvence vrsta Lachnus roboris, Trama troglodytes i Tuberolachnus salignus korištene su kao vanjska grupa (Jousselin i dr. 2013).